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(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯是合成众多血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂的关键手性仲醇。利用酮还原酶制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯具有一定优势,受到了很多研究者的青睐。酮还原酶催化还原酮类化合物需要辅酶还原态的NAD(P)H提供氢。在生产上,为了使酮还原酶催化反应顺利进行降低生产成本,目前主要是将酮还原酶与脱氢酶进行共表达,构建共表达系统。本论文以光滑假丝酵母的酮还原酶CgKR2基因和巨大芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶BmGDH基因作为实验对象,先克隆了两个目标基因,通过基因定向克隆技术,构建了原核表达载体pET17b-TC-CgKR2和pET17b-TC-BmGDH;设计了“T7promoter-T7 RBS-CgKR2-T7 RBS-BmGDH-T7 terminator”双顺反子结构,通过重叠延伸PCR、基因定向克隆等技术构建成表达载体pET17b-TC-CgKR2-BmGDH。经过诱导表达,重组菌BL21-pET17b-TC-CgKR2-BmGDH、BL21-pET17b-TC-C gKR2均高效表达出目的蛋白,表达条带分子量大小与预期一致。上述研究验证了定向克隆的可行性,并为后续的催化活性研究奠定了基础。为了提高发酵工程菌中质粒的稳定性,使CgKR2基因高效稳定表达,本论文设计了质粒依赖系统。将大肠杆菌基因组中条件必须基因敲除,然后将功能正常的基因转移到表达质粒上,这样菌的生长就与质粒形成一种依赖关系。在质粒改造阶段,本论文选择了磷酸丙糖异构酶(tpiA)和葡萄糖胺合酶的基因(glmS)作为质粒依赖系统中所需敲除的条件必须基因。从大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中克隆了tpiA、glmS两个基因。在重组质粒pUCm-tpi A和pET17b-TC质粒的基础上构建了最终的互补表达质粒。论文选用了温敏型质粒pMAK705来进行宿主菌的基因敲除。首先克隆待敲除基因tpiA、glmS前后同源区PCR-T3、PCR-T5、PCR-G3、PCR-G5,对应上下游片段两两重叠延伸,然后连接到温敏型质粒pMAK705中,构建成功tpiA、glmS基因敲除的灭活质粒pMAK705-tpiA和pMAK705-glmS,为CgKR2基因质粒依赖系统的建立奠定了基础。