线粒体是细胞中一种极具生物意义的细胞器,不仅在能量产生和运输的生物学过程中发挥着作用,而且在物质代谢、细胞凋亡和先天免疫等方面也发挥着不可替代的作用。线粒体基质及内外膜间各种物质组成线粒体微环境,只有微环境维持在稳定水平,才能保障线粒体功能的正常运行。影响线粒体微环境稳态的主要因素有p H、极性、粘度、酶种类与含量、温度和氧气浓度等。经研究证明,许多疾病产生的病理原因与线粒体微环境紊乱相关。因此,采用恰当的方法对线粒体微环境进行可视化,对相关疾病的诊断和治疗至关重要。近年来,小分子荧光探针与荧光显微技术结合的荧光成像分析方法（Fluorescence imageing）,为研究者们对线粒体微环境的探索提供了良好的途径。小分子荧光探针解决了传统检测手段无法实时活体成像等问题,且该技术操作简单,生物特异性强,无损伤,以及时空分辨率高等。因此,通过设计小分子荧光探针,结合荧光分析方法对线粒体等细胞器的微环境进行检测,在生物理论和临床研究的探索中有非常广阔的应用前景。本论文中,我们合理设计了三种荧光探针,探针均能特异性靶向线粒体,并分别用于探究线粒体微环境的p H、粘度的变化以及在疾病模型中的应用。首先,为了可视化线粒体内p H的变化,制备出线粒体p H响应的荧光探针Mito-LHB。探针以香豆素衍生物为荧光母体,以羟醛缩合反应连接苯酚作为p H敏感基团。荧光探针发射波长在近红外波段（600-850 nm）,并具有较高的光稳定性和选择性,其末端的羟基可以灵敏地对p H响应,当缓冲溶液p H从碱性变化到酸性（p H=4.0-11.28）时,探针的荧光强度增强了5倍,荧光寿命增长了7倍,实现了对p H环境的灵敏检测。此外,由于氧鎓离子带正电荷,因此Mito-LHB可以特异性地在线粒体内聚集,通过荧光强度和荧光寿命可视化细胞处于酸性、中性或碱性的状态,有效检测线粒体p H的变化,表现出监测线粒体p H变化的特异性。其次,制备了基于D-π-A结构靶向线粒体的荧光探针Mito-YSP,进行定量分析线粒体内粘度的变化。探针以4-氯-1,2-二氢萘亚衍生物为电子供体,二甲基喹啉盐作为电子受体、靶向线粒体官能团和粘度敏感转子。当Mito-YSP处于高粘度环境中,TICT效应减弱,探针形成趋于平面大π的刚性结构,探针发射出较强荧光,并具有较长荧光寿命。在不同粘度的甘油-甲醇体系中测试其荧光寿命随粘度变化,发现其荧光寿命增长与粘度增加呈现出较好的线性关系（R~2=0.99）。此外,Mito-YSP除了能特异性靶向细胞中线粒体外,还能通过共聚焦成像与荧光寿命成像可视化受葡萄糖刺激下细胞内线粒体粘度的变化。同时,探针监成功测了糖尿病小鼠粘度变化。最后,为了进一步定量研究线粒体微环境粘度的变化与疾病的联系,合成了线粒体靶向的荧光探针Mito-VCI。探针以具有良好刚性的香豆素衍生物作为荧光团,通过共轭双键连接具有线粒体靶向特性的带正电荷的苯并吲哚盐,并作为粘度敏感转子。近红外探针Mito-VCI具有高量子产率、高选择性和粘度敏感性的优点。由细胞共定位结果可知,探针能特异性靶向线粒体。同时,Mito-VCI的荧光寿命强烈依赖于溶剂粘度,通过FLIM成像可以明显监测LPS等物质刺激的He La细胞中线粒体粘度变化。此外,通过探针Mito-VCI可观察到全身性炎症组织、小鼠和斑马鱼的粘度变化。