【摘 要】
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恶性肿瘤是目前危害人类健康的重要疾病之一。肿瘤的传统治疗方式主要包括手术治疗、放射治疗和化学治疗。其中手术治疗是实体瘤治疗的首选方案,手术治疗虽能切除大部分肿瘤组织,但不能完全清除残余的肿瘤细胞,易导致肿瘤的复发;放疗和化疗在杀伤肿瘤细胞的同时也会损伤正常组织和细胞,尤其可导致免疫功能的损伤,降低机体的抗肿瘤免疫力,从而影响到肿瘤的治疗效果和患者的生存质量。近年来,免疫治疗已成为肿瘤治疗的重要辅助
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恶性肿瘤是目前危害人类健康的重要疾病之一。肿瘤的传统治疗方式主要包括手术治疗、放射治疗和化学治疗。其中手术治疗是实体瘤治疗的首选方案,手术治疗虽能切除大部分肿瘤组织,但不能完全清除残余的肿瘤细胞,易导致肿瘤的复发;放疗和化疗在杀伤肿瘤细胞的同时也会损伤正常组织和细胞,尤其可导致免疫功能的损伤,降低机体的抗肿瘤免疫力,从而影响到肿瘤的治疗效果和患者的生存质量。近年来,免疫治疗已成为肿瘤治疗的重要辅助治疗手段,其中肿瘤-DC融合疫苗因其携带完整的肿瘤抗原信息和协同刺激分子,可诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫而受到广泛关注。但肿瘤疫苗在应用过程中仍受到一定限制。一方面,肿瘤疫苗的常规递送系统无法满足持续激活机体免疫系统的作用,导致疫苗的免疫原性低下;另一方面,肿瘤微环境（TME）的免疫抑制作用也是影响肿瘤疫苗治疗效果的重要原因,其中TME中的M2型巨噬细胞不仅可促进肿瘤生长,还可分泌抑制性细胞因子抑制T细胞的活化,降低疫苗的免疫激活效率。因此,提高肿瘤疫苗的免疫原性、实现疫苗的长期释放并逆转TME的免疫抑制作用是增强肿瘤疫苗效应、提高机体抗肿瘤免疫效应的关键所在。生物材料作为新兴的载体已广泛应用于肿瘤的治疗。水凝胶由于其含水量高,具有可渗透性及可调节的网络结构,在延长治疗药物的生物活性方面具有诸多优势,适用于多种小分子药物、治疗性蛋白质的控制输送。近年来水凝胶在肿瘤免疫治疗方面的应用也受到广泛关注。基于此,本研究包括以下三部分:1、矿化水凝胶DC-肿瘤膜蛋白疫苗的制备:首先以蚕丝蛋白为材料,构建了酸触发响应释放的Ca CO3矿化的可注射蚕丝蛋白水凝胶,经扫描电子显微镜（SEM）、X-射线衍射（XRD）、流变学测试及元素映射分析证实了该材料的成功合成;检测材料中蛋白的释放情况及Ca CO3的降解性证实了该材料具有酸依赖性释放及长期释药的性能;体内伤口愈合及降解性检测证实了该材料良好的体内安全性。其次,以4T1肿瘤细胞系作为研究对象,与DC细胞进行融合,激光共聚焦实验证实了DC-肿瘤融合细胞的成功构建,提取DC-肿瘤融合细胞膜蛋白,并通过SDS-PAGE检测证实细胞融合后有新蛋白的表达;以该融合膜蛋白作为肿瘤抗原成功构建了矿化水凝胶DC-肿瘤膜蛋白疫苗体系。2、矿化水凝胶DC-肿瘤膜蛋白疫苗的体外抗肿瘤实验:通过流式细胞术检测了该疫苗对CD8+T细胞的直接及间接激活作用;通过ELISA检测IL-12、TNF-α的分泌证实了该疫苗可促进DC细胞的成熟;MTT实验检测了该疫苗活化的CD8+T细胞对4T1肿瘤细胞的特异性杀伤作用;流式细胞术分析及ELISA检测TNF-α、IL-12 p70的分泌证实了Ca CO3对巨噬细胞的极化作用。3、体内抗肿瘤实验:构建4T1荷瘤鼠复发模型,通过瘤体积、及肿瘤组织、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的H＆E染色、肿瘤组织的TUNEL及Ki-67免疫组化染色证实该疫苗可有效抑制肿瘤生长、促进肿瘤细胞凋亡并抑制肿瘤的复发及远处转移;免疫组化及流式分析证实了肿瘤组织有CD8+T细胞的增殖及浸润,证实了局部免疫的激活作用;通过ELISA检测血清中IFN-γ、IL-6、IL-12、TNF-α的分泌证实该疫苗对小鼠系统免疫的激活作用;通过免疫组化检测MHC II类分子和CD163分子的表达、ELISA检测IL-10、IL-12的分泌、流式细胞术检测CD80和CD206的表达均证实该疫苗可促进M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化,从而改善免疫抑制微环境。以上实验结果显示,该矿化水凝胶DC-肿瘤膜蛋白疫苗可通过酸触发释放提高肿瘤疫苗的免疫原性,直接及间接的激活CD8+T淋巴细胞,提高机体的抗肿瘤免疫;同时,Ca CO3的析出可促进M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞的极化,逆转肿瘤微环境的免疫抑制作用。这种“双管齐下”的治疗策略改善了常规肿瘤疫苗免疫原性低、免疫激活效率弱等问题,为有效抑制肿瘤的复发和转移提供新的思路与策略。
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