论文部分内容阅读
研究背景:甲状腺癌是目前最常见的内分泌恶性肿瘤,近年来发病率持续增长。甲状腺癌包括分化型甲状腺癌(>95%)(乳头状甲状腺癌、滤泡型甲状腺癌)和未分化甲状腺癌。在临床确诊的甲状腺恶性肿瘤中未分化甲状腺癌只占其中的不足5%,但占了甲状腺癌死亡人数的一半以上,死亡率超过90%,确诊后平均仅存活6个月。目前甲状腺癌的主要治疗方法包括手术切除、放射性碘消融剩余组织和化疗,但由于未分化甲状腺癌的去分化表型和高度侵袭性导致其疗效不佳,预后差。因此,迫切地需要一种有效、对机体低毒性的化疗药物来改善这一现状。白藜芦醇是一种存在于葡萄、花生、浆果和茶叶中的天然化合物,具有广泛的生物学特性,包括抗糖基化、抗氧化、抗炎症、神经保护、抗癌和抗衰老等。大量研究表明,白藜芦醇具有明确的抗肿瘤作用,相较于临床常用的化疗药物(如:多西紫杉醇、顺铂等)无明显毒副作用。本实验室前期研究结果表明,白藜芦醇处理三株人未分化甲状腺癌细胞系(THJ-16T,THJ-21T和THJ-11T)后发现,白藜芦醇可抑制人未分化甲状腺癌细胞系(THJ-16T和THJ-21T)的增殖并促进其凋亡,但对于同样作为人未分化见状腺癌的THJ-11T细胞系却无上述作用。大量研究表明,STAT3信号通路是白藜芦醇的作用靶点之一,为了探究三株人未分化甲状腺癌细胞系对白藜芦醇敏感性差异的原因,我们检测了这三株细胞系中白藜芦醇对STAT3信号通路活性的影响,发现白藜芦醇能够抑制THJ-16T和THJ-21T细胞中STAT3的磷酸化,却使THJ-11T细胞中STAT3的磷酸化水平增加。因此,我们推测STAT3的异常活化可能是人未分化甲状腺癌THJ-11T细胞系对白藜芦醇耐药的原因。本实验的目的旨在阐明人未分化甲状腺癌THJ-11T细胞系对白藜芦醇耐药的机制,并进一步探究白藜芦醇活化STAT3信号转导通路的原因。实验方法:人未分化型甲状腺癌THJ-11T细胞系,建系于2010年。该细胞系由大连医科大学肿瘤干细胞研究院刘强教授授权转赠。本研究选择人未分化甲状腺癌THJ-11T细胞系(白藜芦醇耐药),分别用白藜芦醇(100μM)、AG490(80μM,JAK2/STAT3信号通路特异性抑制剂)单独或联合处理THJ-11T细胞并通过以下生物学方法阐明人未分化型甲状腺癌THJ-11T细胞系对白藜芦醇耐药的机制:(1)MTT实验检测THJ-11T细胞增殖情况及H/E染色观察细胞形态;(2)TUNEL染色及流式细胞术检测细胞凋亡;(3)RT-PCR、免疫细胞化学染色及Western blot检测不同药物处理后STAT3磷酸化水平、STAT3信号通路上游激活因子(IL-6、LIF)、负性调控因子(SOCS3、PIAS3)及其下游靶基因(survivin、Bcl-2)表达情况。实验结果:(1)MTT结果显示,与正常处理组相比,白藜芦醇处理THJ-11T细胞24h、48h其OD值无统计学差异(P>0.05);AG490处理THJ-11T细胞后OD值有所下降(P<0.05);而白藜芦醇联合AG490处理THJ-11T细胞24h、48h OD值均呈下降趋势,48h下降更为显著(P<0.01)。H/E染色结果显示AG490单独和联合白藜芦醇处理THJ-11T细胞后,细胞数目明显减少,部分细胞出现皱缩。(2)TUNEL和流式细胞术检测结果显示,白藜芦醇单独处理THJ-11T细胞48h后未出现明显凋亡(9.57%);AG490单独处理THJ-11T细胞48h后出现部分凋亡,凋亡率为27.93%;而两者联合处理后细胞出现显著凋亡,凋亡率上升为64.07%。(3)RT-PCR、免疫细胞化学染色及Western blot结果显示,白藜芦醇处理THJ-11T细胞48h后,STAT3的磷酸化(p-STAT3)水平明显升高,以细胞核内更为显著,而AG490单独及联合处理组STAT3的磷酸化水平大幅降低;而白藜芦醇并未引起其下游靶基因survivin和Bcl-2表达水平的进一步升高,这可能与THJ-11T细胞中survivin和Bcl-2初始的高水平表达有关,AG490单独及联合白藜芦醇处理后survivin和Bcl-2的表达水平较未处理组和白藜芦醇处理组显著下降。(4)为了探讨白藜芦醇处理THJ-11T细胞后STAT3异常活化的机制,我们检测了STAT3信号转导通路上游激活因子(IL-6和LIF)及其负性调控因子(SOCS3和PIAS3)的表达情况,结果显示,白藜芦醇处理THJ-11T细胞后LIF和IL-6表达水平升高,SOCS3表达水平降低,而PIAS3表达水平并无明显变化。结论:(1)白藜芦醇不能抑制人未分化甲状腺癌THJ-11T细胞的增殖,也未促进其凋亡;(2)JAK2/STAT3特异性抑制剂AG490可抑制人未分化甲状腺癌THJ-11T细胞增殖,并促进其凋亡;(3)在人未分化甲状腺癌THJ-11T细胞中白藜芦醇活化了STAT3信号转导通路;(4)在THJ-11T细胞中,STAT3信号转导通路上游激活因子IL-6、LIF表达水平的升高及负性调控因子SOCS3表达水平的降低可能是白藜芦醇引起STAT3信号通路活化的重要因素;(5)STAT3的活化是人未分化甲状腺癌THJ-11T细胞对白藜芦醇耐药关键机制,AG490可逆转人未分化甲状腺癌THJ-11T细胞对白藜芦醇的耐药性。