对于家畜来说,肌内脂肪含量(Intramuscular fat,IMF)是影响肉的质量与产量的重要因素,而脂肪细胞分化是动物脂质沉积的重要过程,这一复杂过程包含众多调节因子。miRNA是一类内源性非编码的单链RNA分子,长度约为18～22nt,主要作用于靶基因非编码区来抑制靶基因表达发挥生物学功能,是机体生命活动的重要调节剂,并且有研究表明miRNA以直接或间接方式调节脂肪细胞分化。近年来miRNA通过调节功能基因影响畜产品品质的研究也愈加广泛。miR-421作为一个广谱表达的miRNA多用于潜在的癌症治疗靶标上的研究,在山羊中的研究中仅见其促进山羊绒的生长,尚未见对山羊脂肪生成、脂代谢等方面的报道。本试验以山羊肌内前体脂肪细胞为试验材料,通过转染miR-421agomir和inhibitor探究miR-421对山羊肌内脂肪细胞分化的影响;利用生物信息学软件与双荧光素酶报告试验,预测并鉴定了miR-421可能发挥作用的靶基因,最终阐明miR-421对山羊肌内脂肪细胞分化的影响及可能作用的分子机制,研究结果为揭示miRNAs调控山羊肌内脂肪细胞分化的分子机理提供重要数据。获得的主要研究结果如下:1.miR-421抑制山羊肌内脂肪细胞的分化在山羊肌内前体脂肪细胞中过表达miR-421后脂肪细胞脂滴积聚明显减少,脂肪细胞分化标志基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、LPL、a P2、SREBP1 m RNA表达水平显著下调(P<0.05)。干扰miR-421后与过表达结果呈相反趋势,提示miR-421是山羊肌内脂肪细胞分化的负调控因子。2.miR-421候选靶基因预测分析利用生物信息学预测软件microRNA、Target Scan、DIANA TOOLS,初步筛选获得miR-421靶基因为FGF13,且miR-421作用于FGF13的3’UTR。3.miR-421靶标基因FGF13的克隆及组织表达分析成功克隆获得山羊FGF13基因序列782bp,其中ORF区738 bp,编码245个氨基酸,该基因广泛表达于山羊各组织(心、肝、脾、肺、肾、脂肪、背最长肌),其中在肌肉组织中FGF13的表达水平最高,在心脏与脾脏中也存在较高水平的表达。4.FGF13促进山羊肌内脂肪细胞分化在山羊肌内脂肪细胞分化过程中FGF13时序表达整体呈上升趋势,并在第5d达峰值。在山羊肌内前体脂肪细胞中转染特异性FGF13-si RNA发现,与对照组相比FGF13基因表达水平被显著降低,脂质积聚减少,显著下调脂肪细胞分化标志基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ和LPL m RNA表达水平(P<0.05)。5.miR-421通过靶向FGF13抑制山羊肌内脂肪细胞分化首先克隆获得山羊FGF13基因3’UTR序列1300 bp,并构建Pmir GLO-FGF13-3’UTR荧光素报告基因,分别与miR-421 agomir/NC共转染至293T细胞后会显著降低双荧光素酶的活性(P<0.01)。同时,在山羊肌内脂肪细胞中过表达miR-421显著抑制FGF13 m RNA表达水平(P<0.01)。综上表明,miR-421通过特异性靶向FGF13 3’UTR抑制FGF13的表达水平进而抑制了山羊肌内脂肪细胞的分化。