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鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是中国南方数省高发的鼻咽部恶性上皮源性肿瘤。目前的研究表明,NPC发病是一个多因素、多阶段的过程,主要与EB病毒、化学致癌物以及遗传等因素相关。血清学以及组织学的证据表明,EB病毒与NPC密切相关,在NPC细胞以及鼻咽部非典型增生的上皮细胞中都可以检测到EB病毒,但是在鼻咽部正常上皮细胞中却未能检测到EB病毒,表明EB病毒可能在NPC发病的早期感染了上皮细胞,但其感染细胞的机制以及在肿瘤发生发展中的作用仍不明确。根据肿瘤发生的三阶段学说,肿瘤促进剂在肿瘤发生中也起到一定的关键性作用。冈田酸(okadaic acid,OA)作为蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1,PP1)以及蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)的特异性抑制剂,可以显著增加细胞内磷酸化蛋白的含量,是一种有效的肿瘤促进剂,因此OA可以作为研究肿瘤发生发展机制的一种有用工具。 蛋白质组学(proteomics)技术是一种新的、高通量的后基因组研究方法,近年来广泛地应用于人类疾病,尤其是肿瘤发病机制的研究。经典的方法主要通过二维电泳分离蛋白,然后质谱分析得到肽质量指纹图谱,通过因特网检索得到蛋白的相关信息。将蛋白质组学分析方法应用于EBV与鼻咽癌关系的研究,有利于从一个崭新的角度,对鼻咽癌发生发展机制进行有益的探索。 本课题利用2×2实验设计,以空白处理组为阴性对照,分别设立EB病毒、OA和EB病毒+OA实验组,体外感染或者处理鼻咽癌细胞系HNE-1,重点分析EB病毒感染前后细胞内蛋白表达谱的变化以及OA在其中可能发挥的作用,从蛋白质水平,初步探索EB病毒与NPC的关系,并提供可能的新线索。 本课题进行了如下工作: 1、利用二维电泳技术,通过对HNE一1细胞系的实验,稳定和优化了蛋白提取方法及等电聚焦中的各种条件,获得了不同样本的抽提蛋白及2一DE图谱; 2、分别用EB病毒、OA、EB病毒+OA处理HNE一1细胞,M飞,f实验观察OA对HNE一l细胞生长的影响;处理后第八天抽提各组细胞基因组DNA,并制作细胞滴片,PCR、Southem blot、原位杂交及电镜观察病毒对细胞的感染情况。PeR、southem blot显示,在EB病毒、EB病毒+OA两处理组中,细胞基因组DNA中有BajmHIW片段的整合;在EB病毒处理组细胞中,可以通过电镜观察到明确的病毒颗粒;原位杂交结果显示,单独EB病毒感染组EBER一1检出率为9.294%,EB病毒+OA组EBER一1检出率为9.916%,统计学分析(xZ检验)结果表明,两组间EB病毒感染率没有显著性差异。 3、通过二维电泳方法,分析了不同处理组间蛋白质表达谱的变化情况。与空白对照组相比,EB病毒处理组消失了7个蛋白,增加了7个蛋白;OA处理组消失了3个蛋白,增加了11个蛋白:EB病毒+OA协同处理组共有14蛋白质发生变化,其中5个蛋白消失,增加了9个蛋白。增加的9个蛋白中,有5个蛋白质为EBV+OA处理组所特有,2个蛋白在EB病毒处理组同时出现,2个蛋白在OA处理组中同时出现。根据2一DE图谱提供的蛋白质等电点以及分子量的信息,通过因特网检索,对蛋白的功能进行初步分析。结果表明,EB病毒感染细胞之后,可能通过病毒基因的表达产物,影响宿主细胞内DNA合成及基因转录,上调或者下调一系列蛋白的表达,最终促进细胞生长,抑制细胞凋亡;OA则可能是通过对蛋白磷酸酶的抑制,使细胞内相关蛋白过度磷酸化,影响细胞内的信号转导通路,改变基因表达;同时,EB病毒与OA在细胞内可能会对相同的途径影响发挥作用,在某些通路中可能相互促进,而在某些通路中可能存在一定拮抗性的作用。 因此,通过本研究可以得到如下结论: 1、EB病毒可以直接感染鼻咽癌细胞株HNE一l;OA对EB病毒感 染率没有影响。 一4-2、EB病毒与OA可分别或联合通过对细胞内一些蛋白的表达发挥 影响,改变蛋白表达水平以及蛋白功能状态。本研究为进一步探 索这些蛋白在鼻咽癌变中的作用提供了线索。