鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是中国南方数省高发的鼻咽部恶性上皮源性肿瘤。目前的研究表明，NPC发病是一个多因素、多阶段的过程，主要与EB病毒、化学致癌物以及遗传等因素相关。血清学以及组织学的证据表明，EB病毒与NPC密切相关，在NPC细胞以及鼻咽部非典型增生的上皮细胞中都可以检测到EB病毒，但是在鼻咽部正常上皮细胞中却未能检测到EB病毒，表明EB病毒可能在NPC发病的早期感染了上皮细胞，但其感染细胞的机制以及在肿瘤发生发展中的作用仍不明确。根据肿瘤发生的三阶段学说，肿瘤促进剂在肿瘤发生中也起到一定的关键性作用。冈田酸(okadaic acid，OA)作为蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1，PP1)以及蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的特异性抑制剂，可以显著增加细胞内磷酸化蛋白的含量，是一种有效的肿瘤促进剂，因此OA可以作为研究肿瘤发生发展机制的一种有用工具。 蛋白质组学(proteomics)技术是一种新的、高通量的后基因组研究方法，近年来广泛地应用于人类疾病，尤其是肿瘤发病机制的研究。经典的方法主要通过二维电泳分离蛋白，然后质谱分析得到肽质量指纹图谱，通过因特网检索得到蛋白的相关信息。将蛋白质组学分析方法应用于EBV与鼻咽癌关系的研究，有利于从一个崭新的角度，对鼻咽癌发生发展机制进行有益的探索。 本课题利用2×2实验设计，以空白处理组为阴性对照，分别设立EB病毒、OA和EB病毒+OA实验组，体外感染或者处理鼻咽癌细胞系HNE-1，重点分析EB病毒感染前后细胞内蛋白表达谱的变化以及OA在其中可能发挥的作用，从蛋白质水平，初步探索EB病毒与NPC的关系，并提供可能的新线索。 本课题进行了如下工作: 1、利用二维电泳技术，通过对HNE一1细胞系的实验，稳定和优化了蛋白提取方法及等电聚焦中的各种条件，获得了不同样本的抽提蛋白及2一DE图谱; 2、分别用EB病毒、OA、EB病毒+OA处理HNE一1细胞，M飞，f实验观察OA对HNE一l细胞生长的影响;处理后第八天抽提各组细胞基因组DNA，并制作细胞滴片，PCR、Southem blot、原位杂交及电镜观察病毒对细胞的感染情况。PeR、southem blot显示，在EB病毒、EB病毒+OA两处理组中，细胞基因组DNA中有BajmHIW片段的整合;在EB病毒处理组细胞中，可以通过电镜观察到明确的病毒颗粒;原位杂交结果显示，单独EB病毒感染组EBER一1检出率为9.294%，EB病毒+OA组EBER一1检出率为9.916%，统计学分析(xZ检验)结果表明，两组间EB病毒感染率没有显著性差异。 3、通过二维电泳方法，分析了不同处理组间蛋白质表达谱的变化情况。与空白对照组相比，EB病毒处理组消失了7个蛋白，增加了7个蛋白;OA处理组消失了3个蛋白，增加了11个蛋白:EB病毒+OA协同处理组共有14蛋白质发生变化，其中5个蛋白消失，增加了9个蛋白。增加的9个蛋白中，有5个蛋白质为EBV+OA处理组所特有，2个蛋白在EB病毒处理组同时出现，2个蛋白在OA处理组中同时出现。根据2一DE图谱提供的蛋白质等电点以及分子量的信息，通过因特网检索，对蛋白的功能进行初步分析。结果表明，EB病毒感染细胞之后，可能通过病毒基因的表达产物，影响宿主细胞内DNA合成及基因转录，上调或者下调一系列蛋白的表达，最终促进细胞生长，抑制细胞凋亡;OA则可能是通过对蛋白磷酸酶的抑制，使细胞内相关蛋白过度磷酸化，影响细胞内的信号转导通路，改变基因表达;同时，EB病毒与OA在细胞内可能会对相同的途径影响发挥作用，在某些通路中可能相互促进，而在某些通路中可能存在一定拮抗性的作用。 因此，通过本研究可以得到如下结论: 1、EB病毒可以直接感染鼻咽癌细胞株HNE一l;OA对EB病毒感 染率没有影响。 一4-2、EB病毒与OA可分别或联合通过对细胞内一些蛋白的表达发挥 影响，改变蛋白表达水平以及蛋白功能状态。本研究为进一步探 索这些蛋白在鼻咽癌变中的作用提供了线索。