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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)以母猪繁殖障碍和各种年龄猪呼吸道症状为主要特征，给世界养猪业带来了大量的财产损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)具有变异快、毒株多和保护性免疫应答慢等特点，并具有复杂的免疫逃避机制，所以现有疫苗免疫不能对异源毒株感染提供良好保护，新型疫苗研究面临巨大挑战。RNA干扰是快速发展的抗病毒感染新策略，但干扰RNA体内运送一直是制约其应用的瓶颈。本课题组先前用重组质粒转染Marc-145细胞，发现5或3非翻译区(un-translated region,UTR)人工微小RNA(artificial microRNA,amiRNA)能有效抑制PRRSV复制，但重组质粒转染巨噬细胞的效率较低，临床应用受到限制。本研究以重组腺病毒为传送载体，探索用3UTR amiRNA阻断PRRSV复制的可行性，为重组腺病毒介导RNA干扰策略的临床应用提供依据。 为了构建表达amiRNA的重组腺病毒(rAd)，分别将先前构建的3UTR amiRNA和对照amiRNA表达盒克隆入腺病毒穿梭载体pShuttle-GFP，分别用重组载体pShuttle-amiR3UTR-GFP和pShuttle-amiRcon-GFP转化含腺病毒基因的大肠杆菌，经抗性筛选获得同源重组克隆，用其转染AAV-293细胞，获得了重组腺病毒rAd-amiR3UTR-GFP和rAd-amiRcon-GFP。分别用不同剂量rAd-amiR3UTR-GFP转染猪肺巨噬细胞(Porcinealveolar macrophage，PAM)及其细胞系3D4/163，转导后24h进行荧光显微镜观察，结果显示重组腺病毒能转导两种巨噬细胞，但PAM细胞转导效率显著低于3D4/163细胞系，需100个感染指数(MOI)才能有效转导。在转导后48h收获细胞提取RNA，用amiRNA特异引物进行定量RT-PCR检测，结果显示重组腺病毒转导的两种巨噬细胞均能表达序列特异amiRNA，其表达水平具有重组腺病毒剂量依赖性，3D4/163细胞系amiRNA表达水平高于PAM细胞。在转导后不同时间进行定量RT-PCR检测，结果显示两种巨噬细胞的amiRNA表达较稳定，至少持续72h。这些研究结果表明，重组腺病毒可体外转导猪巨噬细胞并稳定表达序列特异amiRNA，可用于PRRSV抗感染体内研究。 为了评价rAd表达的amiRNA对PRRSV复制的抑制作用，分别用不同剂量rAd-amiR3UTR-GFP和rAd-amiRcon-GFP转导PAM及其3D4/163细胞系，转导后48h用相同剂量VR2332株PRRSV感染，感染后24h收获细胞提取RNA，用PRRSV ORF7基因特异引物进行定量RT-PCR检测，结果与rAd-amiRcon-GFP转导组相比，rAd-amiR3UTR-GFP转导组的PRRSV基因组拷贝数随重组腺病毒转导剂量的增加呈明显下降趋势，3D4/163细胞的下降趋势更为明显。感染后24h收获细胞，用N蛋白特异抗体进行免疫转印检测，结果显示Ad-amiR3UTR-GFP转导能抑制PRRSVN蛋白表达，抑制作用与重组腺病毒转导具有剂量依赖关系。再用相同剂量重组腺病毒转导PAM及其3D4/163细胞系，转导后48h用不同剂量VR2332株PRRSV感染，定量RT-PCR和免疫转印检测结果显示rAd-amiR3UTR-GFP转导能抑制PRRSV复制及其N蛋白表达，而且与PRRSV感染具有剂量依赖关系。在PRRSV感染后不同时间收获病毒，在Marc-145细胞上进行病毒滴定，结果与rAd-amiRcon-GFP转导组相比，rAd-amiR3UTR-GFP转导的两种巨噬细胞的PRRSV滴度均显著下降，至少维持96h。再用相同剂量重组腺病毒转导PAM及其3D4/163细胞系，转导后48h用不同毒株PRRSV感染，病毒滴定结果显示rAd-amiR3UTR-GFP转导对3株PRRSV复制具有相似的抑制作用。这些研究结果表明，重组腺病毒是有效的猪巨噬细胞amiRNA传送载体，表达的amiR3UTR能抑制不同毒株PRRSV复制，rAd-amiR3UTR-GFP可用于体内抗PRRSV的深入研究。