错配修复(Mismatch repair,MMR)是DNA修复的主要途径之一,其主要负责细胞DNA复制时因聚合酶加入错误碱基或受内外因素影响引起的错配的修复,这一修复途径在细菌、真核生物中均保守存在,对维持基因组稳定性起重要作用。经典的错配修复过程是:当DNA发生错配时,MutS蛋白会识别并结合错配位点,招募MutL蛋白形成复合物。该复合物刺激MutH的内切酶活性,从而能够从错配位点的5’端或3’端来切割含错配碱基的DNA链产生切口(nick)。之后,UvrD解旋酶将MutH替代下来并将DNA解螺旋至错配位点,ExoI核酸酶切除含错配碱基的这一段DNA片段。接着在DNA聚合酶Ⅲ holoenzyme和单链 DNA 结合蛋白(single stranded-DNA binding protein,SSB)的作用下修补缺口并在DNA连接酶的作用下连接,最后甲基化酶Dam酶甲基化子链形成成熟的DNA链。大量研究证实,经典的错配修复途径蛋白MutS/MutL及其同源物存在于大多数细菌、真核生物及少数古菌中,而在大多数古菌、放线菌及结核菌中缺乏此修复系统,因此对这些微生物中的错配修复机制仍不甚了解。最近,一种新型的错配修复蛋白EndoMS在广古菌炽热球菌Pyrococcus furiosus中鉴定出来,并对其在Thermococcus kodakaraensis中同源蛋白进行了研究。体外实验表明,广古菌T.kodakaraensis中EndoMS仅识别部分错配种类,将错配底物切割成双链断裂。然而,细胞对于其它错配如何识别和修复、断裂形成之后如何完成修复等很多问题仍不清楚。本文以冰岛硫化叶菌Sulfolobus islandicus为对象,利用生物化学和遗传学方法,分析EndoMS在泉古菌中的性质、功能和作用机制。首先我们克隆表达出SisEndoMS蛋白,以32P标记的含错配位点的寡核苷酸链为底物测定其内切酶活性,发现该蛋白具有一定的底物特异性,在Mg2+条件下只对G-G,G-T和T-T三种错配类型有切割作用。确认该蛋白具有内切酶活性后,为进一步探究其在体内功能,我们进行了过表达菌株表型分析与基因敲除分析。我们构建并筛选了该蛋白的过表达菌株,测定了过表达菌株的生长状况,发现过表达该蛋白后,造成菌株明显的生长迟缓。同时,我们也利用流式细胞技术与显微镜技术分析观察了菌株的细胞周期与形态,发现过表达菌株的二倍体含量明显高于对照组,而且细胞体积增大,这些结果说明过表达该蛋白阻止DNA复制后的分离,从而影响细胞分裂。同时我们利用同源置换策略将该基因从基因组上敲除,并对敲除株表型进行了测定。发现在液体培养基中,无论是否加有DNA损伤剂,敲除型菌株都比野生型生长稍快;而在固体平板上,敲除株形成菌圈数比野生型少,暗示着SisEndoMS在硫化叶菌修复途径中起重要作用,推测原因可能为当基因缺失,细胞受到外界环境压力而产生错误时,在液体培养基中生长的敲除型菌株由于修复系统的不完整,导致细胞缺乏对错误的校正,使细胞能够较快的复制与分裂,而在固体培养平板上,细胞由于外界环境压力的加强,敲除型菌株在缺失修复系统后不能有效修复错误,导致生长状况不理想,形成较少的菌圈。由于蛋白只对三种错配方式进行切割,而机体中存在八种碱基错配方式,因此为了解蛋白在何种情况下能够识别八种错配方式,进一步明确蛋白在体内的功能,扩大蛋白实际应用价值,我们通过同源建模确认该蛋白识别位点并对其突变,最后发现将蛋白71位天冬氨酸突变为苏氨酸时,在2mM Mn2+条件下,蛋白能够识别八种错配并对其进行有效切割。