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第一章过表达IDO大鼠骨髓间充质干细胞分泌外泌体在心脏移植存活中作用目的:检测对比过表达IDO大鼠骨髓间充质干细胞分泌的exosomes(BMSCsIDO-exosomes)体外对DC、T细胞的调节作用,体内进一步验证体外实验结果,力图证明BMSCsIDO-exosomes可以有效提高异位移植心脏的存活。。方法:体外采用A、BMSCsIDO-exosomes与DC共培养。B、BMSCsIDO-exosomes与T细胞共培养。C、BMSCs IDO-exosomes与DC+T细胞共培养。D、BMSCs空载体-exosomes与DC共培养。E、BMSCs空载体-exosomes与T细胞共培养。F、BMSCs空载体-exosomes与DC+T细胞共培养。G、BMSCs-exosomes与DC共培养。H、BMSCs-exosomes与T细胞共培养。I、BMSCs-exosomes与DC+T细胞共培养。J、DC单独培养。K、T细胞单独培养。L、DC与T细胞共同培养。分别在共培养48h,72h、96h后进行流式细胞术检测。其中A、D、G、J组检测DC表面分子CD40、CD86、CD80、MHCII、CD274、CD45RA、CD45RA+CD45RB、OX62。B、E、H、K组检测T细胞亚群Treg和CD3、CD4、CD8的表达。C、F、I、L组检测CD40、CD86、CD80、MHCII、CD274、CD45RA、CD45RA+CD45RB、OX62和Treg、CD4、CD8表达量。2、通过RT-PCR检测48、72、96小时A、C、D、F、G、I、J及L组中IDO表达量。3、液相芯片检测C、F、I、L组在共培养48、72、96小时上清液中IL-1ɑ、IL-4、IL-1β、IL-2、IL-10、IFNr、IL-18、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3炎性因子的变化。体内实验:向异位心脏移植大鼠注射采用Dir预染的BMSCs IDO-exosomes、BMSCs空载体-exosomes、BMSCs-exosomes后2天、4天及7天,将移植未处理组、给予吗替麦考组及正常大鼠作为对照组。1、利用心脏彩超检测移植心脏心功能变化。2、采用小动物活体成像系统进一步评估移植心脏局部荧光强度。3、取上述各时间点各组受体大鼠脾脏,采用流式细胞技术检测CD40、CD86、CD80、MHCII、CD274、CD45RA、CD45RA+CD45RB、Treg细胞的表达。4、再取上述各时间点各组受体大鼠移植心脏,采用HE染色评估移植心脏炎性细胞的浸润。5、利用液相芯片检测上述各时间点各组受体大鼠血清中IL-1ɑ、IL-4、IL-1β、IL-2、IL-10、IFNr、IL-18、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3炎性细胞因子的变化。结果1、各组在与DC共培养时,可见在48、72、96小时,共培养组中BMSCs IDO-exosomes+DC培养组中DC表面分子CD40、CD86、CD80、MHCII、CD45RA、CD45RA+CD45RB、OX62表达是降低的,而CD274的表达是升高的。说明IDO调节的免疫细胞为DC。2、各组在与T细胞共培养时,可见在48、72、96小时,共培养组中BMSCsIDO-exosomes+T细胞培养组中Treg细胞数量是升高的,CD4阳性T细胞的变化无明显规律性,但CD8阳性T细胞是降低的,说明IDO调节T细胞群体为CD8阳性T细胞,并可增加Treg细胞数量。3、各组在与DC+T细胞共培养48、72、96小时,可见:BMSCs IDO-exosomes+DC+T细胞培养组中DC表面分子CD40、CD86、CD80、MHCII、CD45RA、CD45RA+CD45RB、OX62表达是降低的,而CD274的表达是升高的。再次说明IDO调节的免疫细胞为DC。Treg细胞数量是升高的,CD4阳性T细胞的变化无明显规律性,但CD8阳性T细胞是降低的,再次说明IDO调节T细胞的群体为CD8阳性T细胞,并可增加Treg细胞数量。4、各组在与DC、DC+T共培养时,可见在48、72、96小时BMSCs IDO-exosomes+DC+T细胞培养组中IDO表达量最高,且随着时间有增加趋势。5、将各组与DC+T细胞共培养时,可见在48、72、96小时各组共培养上清中IL-1ɑ、IL-4、IL-1β、IL-2、IFNr、IL-18是减低的且与其它各组有显著性差异。IL-10、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3表达量是升高的且与其它各组有显著性差异。体内实验:1、大鼠异位心脏移植模型建立后,给予相应处理,可见BMSCs IDO-exosomes处理后2天、4天及7天移植心脏的EF、FS与其余各组有提高。2、采用小动物活体成像系统也可见BMSCs IDO-exosomes组移植心脏局部荧光强度最强。3、在2天、4天及7天时,可见BMSCs IDO-exosomes组脾脏细胞的CD40、CD86、CD80、MHCII、CD45RA、CD45RA+CD45RB表达降低,而CD274、Treg细胞的表达增高。4、在2天、4天及7天时,可见BMSCs IDO-exosomes组血清中IL-1ɑ、IL-4、IL-1β、IL-2、IFNr、IL-18是减低的且与其它各组有显著性差异。IL-10、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3表达量是升高的,且与其它各组有显著性差异。5、HE染色可见BMSCs IDO-exosomes组较其它组炎性细胞浸润数量明显减少。结论BMSCsIDO-exosomes可以通过有效调节免疫DC、T细胞表面分子及炎性细胞因子的表达。从多个免疫层面提高移植心脏的存活。第二章BMSCsIDO-exosomes-microRNA表达谱的检测目的:检测BMSCsIDO-exosomes中与免疫相关的micro RAN。方法:采用illumina small RNA技术检测BMSCsIDO-exosomes、BMSCs空载体-exosomes及BMSCs-exosomes中的micro RAN,构建小RNA文库,对所建文库进行质检,最后采用GO、Pathway等生物信息学处理,提取其中与免疫相关的micro RNA。结果:采用筛选标准为p≤5%,同时FC（abs）≥1.5或者≤0.67具有显著性差异,并同时需要满足以下条件:1、明确BMSCs空载体-exosomes与BMSCs-exosomes有显著性差异的micro RNA。明确BMSCsIDO-exosomes与BMSCs-exosomes含有的有显著性差异的micro RNA。2、在BMSCsIDO-exosomes与BMSCs-exosomes含有的有显著性差异的micro RNA中去除BMSCs空载体-exosomes与BMSCs-exosomes有显著性差异的micro RNA,无论这个基因是上调还是下调。3、完成上述两个条件后,列出前20个上调或下调的关键micro RNA。4、对上述前20位上调及下调的micro RNA完成KEGG和GO富集。我们根据KEGG分析可见上调micro RNA根据基因预测结果显示涉及3条pathway途径,分别为:Intestinal immune network for Ig A production（CD80、AICDA、CD28、ICOS）、Primary immunodeficiency（AICDA、JAK3、ICOS）、Autoimmune thyroid disease（CD80、TSHR、RT1-N2、CD28）。根据KEGG分析可见下调micro RNA根据基因预测结果显示涉及2条pathway途径,分别为Intestinal immune network for Ig A production（CXCL12）、Primary immunodeficiency（CD4、RAG2）。根据基因明确其中涉及免疫的上调miro RNA有7个,其中mi R-540-3p的FC值上升幅度最大的。其中涉及免疫下调的基因有3个,其中mi R-338-5p的FC值下降幅度最大的。因此,我们重点验证的micro RNA为:上调的mi R-540-3p和下调的mi R-338-5p。结论:通过采用illumina small RNA技术检测BMSCsIDO-exosomes内与免疫相关的micro RNA,最终确认上调重点micro RNA为:mi R-540-3p。下调重点micro RNA为:mi R-338-5p。第三章TMT标记定量蛋白质组学分析外泌体内有关免疫调节蛋白目的:采用TMT标记定量蛋白质组学分析BMSCs IDO-exosomes内有关免疫调节蛋白。方法:采用TMT标记BMSCsIDO-exosomes、BMSCs空载体-exosomes及BMSCs-exosomes中含有的蛋白,获得原始数据,采用GO、Pathway等生物信息学处理,提取其中有关免疫调节蛋白。结果:本项研究一共鉴定到1392蛋白质,其中1158个蛋白质包含定量信息。如果设定ratio>1.2时,t-test p-value<0.05为标准,认为蛋白发生上调;ratio<0.83时,t-test p-value<0.05为标准,认为该蛋白发生下调。那么在定量到的蛋白质中,BMSCs IDO-exosomes比BMSCs-exosomes中,共有317个蛋白发生上调,114个蛋白发生下调。BMSCs IDO-exosomes比BMSCs空载体-exosomes中共有335个蛋白发生上调,108个蛋白发生下调。BMSCs空载体-exosomes比BMSCs-exosomes组中共有34个蛋白发生上调,43个蛋白发生下调。基于上述数据,进一步采用如下筛选标准:1、BMSCs空载体-exosomes比BMSCs-exosomes比较组中的差异蛋白作为背景,把BMSCs IDO-exosomes比BMSCs-exosomes组和BMSCs IDO-exosomes比BMSCs空载体-exosomes组中与BMSCs空载体-exosomes比BMSCs-exosomes比较组中相同变化趋势的差异蛋白剔除掉。2、把BMSCs IDO-exosomes比BMSCs-exosomes组和BMSCs IDO-exosomes比BMSCs空载体-exosomes组中变化趋势不一样的蛋白剔除掉。3、符合1和2条件的蛋白,按照1.2倍往下分析。采用两种方法:1、列举出排名前20的蛋白（上调20个、下调20个）。2、根据KEGG Pathway,筛选出符合1和2条件的蛋白其中涉及到免疫相关蛋白有5个,分别为:Transforming protein Rho A、Mitogen-activated protein kinase 1、Cell division control protein 42 homolog、Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11、Four and a half LIM domains 1。对两种方法取交集可见其中的关键蛋白为Four and a half LIM domains 1。结论:通过采用TMT标记BMSCs IDO-exosomes内蛋白,从而鉴别出BMSCs IDO-exosomes中涉及免疫调节的关键蛋白为FHL-1。