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背景癌症是恶性肿瘤,来自于细胞的异常和不受控制的分裂,并侵入和破坏周围组织。肿瘤的异质性是恶性肿瘤的特征之一,而肿瘤的异质性与肿瘤细胞周边的微环境的作用息息相关。肿瘤结构包括肿瘤细胞和肿瘤微环境（TME）,肿瘤微环境又由基质细胞和细胞外基质（ECM）所构成。基质细胞,如血管生成性血管细胞（AVCs）,浸润免疫细胞（IICs）和癌相关的成纤维细胞（CAFs）,它们通过产生生长因子,趋化因子和基质降解酶来促进肿瘤的侵袭,增殖和转移。肿瘤微环境与肿瘤细胞之间相互影响,对肿瘤的发生,生长和转移起着至关重要的作用。且为纳米递药系统递送药物提供障碍,减弱细胞毒性药物的递送和活性,极大地影响肿瘤细胞对药物的敏感性治疗,这也是构成抗癌药物耐药的原因之一。靶向肿瘤微环境的递药系统对改善药物输送和重塑肿瘤微环境有着重要的作用。靶向治疗唯一的靶点肿瘤细胞,可能对恶性肿瘤无效。因此,靶向癌细胞和肿瘤微环境是目前治疗肿瘤的新的策略。CAFs是肿瘤间质中主要的细胞类型,可分泌多种ECM成分,如胶原蛋白,纤维连接蛋白和细胞外基质降解蛋白酶等。与肿瘤细胞通过复杂的细胞-细胞间相互作用,为肿瘤细胞提供生长环境,且形成纳米递药系统的障碍。此外,CAFs还分泌多种生长因子如血管内皮生长因子（VEGF）,特异性表达多种蛋白质如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,成纤维细胞活化蛋白（FAP）和纤维细胞特异蛋白1（FSP-1角蛋白）。这些基质成分可诱导肿瘤纤维化,血管生成和转移。在近年来的研究中,越来越多的研究通过靶向CAFs,来切断其与肿瘤细胞相互作用。因此,基于纳米技术的联合治疗肿瘤细胞和癌相关成纤维细胞可能是抗肿瘤治疗一个新的治疗方法。使用抗癌药物和抗癌相关成纤维细胞药物的二元混合共递药纳米系统,联合治疗癌细胞与癌相关肿瘤细胞,可重塑肿瘤微环境,提高生物利用度,提高抗癌疗效。实验目的我们设计并制备了一种二元混合共递药纳米颗粒,命名为TPNPDOX&PPNPLOS。该共递药系统是两种不同的纳米颗粒（TPNP和PPNP）分别荷载两种细胞靶点不同的药物,一种为抗纤维化药物LOS,另一种为抗癌药DOX。再将以不同质量比物理混合,用于两种小分子药物的共递送。在这项研究中,两种纳米粒分别靶向TME中的CAFs与癌细胞。我们证实,TPNPDOX&PPNPLOS可在肿瘤微环境中释放LOS,并在肿瘤细胞中释放DOX,这种逐级释放可杀死CAFs,调节肿瘤微环境,从而更有效的杀灭肿瘤细胞,达到协同抗癌的功效。实验方法1.制备表征:采用乳化溶剂挥发法制备TPNP和TPNPDOX,溶剂铸造法制备PPNP和PPNPLOS。检测TPNP、TPNPDOX、PPNP、PPNPLOS的粒径和表面电位;通过透射电子显微镜观察几种纳米颗粒和胶束的分散情况以及pH敏感的形态学变化;检测TPNP、TPNPDOX、PPNP、PPNPLOS的粒径和表面电位以及pH敏感的粒径变化;制备TPNPDOX和PPNPC6,即用多柔比星（DOX）红色荧光标记的TPNP和用香豆素-6（C6）绿色荧光标记的PPNP,将其物理混合,通过激光共聚焦显微镜观察二元混合共递药系统的分散特征;通过傅立叶变换红外光谱（FTIR）和X射线衍射（X-RD）检测纳米颗粒以及胶束的物理和化学结构判断药物的包封情况;使用UV-Vis分光光度计测量药物在纳米粒和胶束中的包封率和载药量,以及体外pH敏感释放的特征。2.CAFs细胞激活:用转化生长因子β1（TGF-β）激活NIH3T3细胞成CAFs,用免疫荧光通过激光共聚焦显微镜观察细胞中α-SMA蛋白表达;用Western Blot检测不同浓度转化生长因子β1（TGF-β）处理后,细胞中α-SMA和FAP的蛋白表达情况,从而选取合适的TGF-β的浓度。3.生物效应:利用CCK-8的方法测定TPNP、PPNP对Hep G-2和NIH3T3细胞的细胞毒性,以评估材料的安全性。用CCK-8试剂盒分别测定DOX、LOS、DOX+LOS、TPNPDOX和PPNPLOS以及TPNPDOX&PPNPLOS对Hep G-2和CAFs细胞的细胞毒性,并计算IC50值,评估二元混合共递药系统对药物抗癌效果的改善情况。4.细胞摄取与迁移:制备TPNPDOX,用激光共聚焦显微镜观察比较游离DOX在Hep G-2细胞中的摄取与外排情况,以及TPNPDOX在Hep G-2细胞中的摄取与迁移过程。结果1.检测结果显示,几种纳米颗粒均成球形,粒径均一且分散性良好,TPNP纳米颗粒约为168 nm,PPNP胶束粒径约为120 nm;TPNPDOX载药纳米颗粒约为191 nm,PPNPLOS载药胶束粒径约为130 nm。并且在不同酸性pH值下都有不同程度的裂解。纳米颗粒和胶束均带有负电荷,有利于物理混合的分散性和其在血液中的运输,且可通过内吞作用内化。荧光示踪技术证明,两种纳米粒和胶束混合后各自分散且分散性良好。2.红外和X-射线衍射的结果显示,TPNP、PPNP的成功合成和两种药物的成功包载。纳米颗粒和胶束都有较高的包封和载药效率。体外药物释放实验结果显示,PPNPLOS胶束具有微环境弱酸响应性,可在pH=6.5释放药物,而TPNPDOX纳米颗粒也具有pH敏感性,可在PH=5.8中释放药物。3.细胞激活免疫荧光结果表明,使用TGF-β激活NIH3T3后,用激光共聚焦观察其细胞质有明显红色荧光标记的α-SMA蛋白的表达。证明NIH3T3成功激活为CAFs。Western Blot结果显示,与其他各浓度相比,TGF-β浓度为5 ng/ml具有最佳的α-SMA和FAP蛋白的表达效果。4.体外细胞毒性实验结果表明,两种递药材料对Hep G-2和NIH3T3两种细胞具有较低的细胞毒性,证明其材料安全性。而药物对Hep G-2和CAFs两种的细胞毒性结果则表明,联合递送抗癌药物DOX及抗纤维药物LOS,可改善抗癌疗效。并且二元混合递药系统对两种细胞的毒性显著高于两种游离药物的混合。可减少药物的使用剂量,降低毒副作用。5.细胞摄取与迁移途径实验结果显示,游离的DOX可进入Hep G-2细胞的细胞核。TPNPDOX纳米颗粒在2 h-6 h内被细胞摄取进细胞,堆积在细胞质中。在6 h-24 h时越来越多的DOX迁移并聚积到细胞核。且与游离DOX相比,有更多的红色荧光出现在细胞核内。这表明,纳米颗粒可有效地将药物运送至细胞核并在细胞核中积累,完美地发挥其药理作用。结论在本研究中,我们设计并制备了具有双重pH敏感的二元混合共递药系统,即TPNPDOX荷载了抗癌药物DOX以及PPNPLOS荷载抗纤维化药物LOS。PPNPLOS可在肿瘤微环境pH=6.5下释放药物LOS有效的杀死癌相关成纤维细胞,消除细胞外基质的屏障,改善肿瘤微环境,提高肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性。TPNPDOX可有效递送细胞毒性药物到达肿瘤细胞内,在肿瘤细胞质pH=5.8时释放药物DOX发挥其药理作用。两种递药系统联合治疗可有效杀灭肿瘤细胞和肿瘤相关成纤维细胞,并减少抗癌药物的使用剂量,减少其毒副作用,增强其抗癌疗效,从而达到良好的协同抗癌的治疗效果。