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国际疼痛研究学会将疼痛定义为“与实际或潜在的组织损伤相关的不愉快的感觉和情绪体验”。疼痛是一种复杂而不愉快的感受并伴有自主的、心理的和行为的反应。急性疼痛经过有效的治疗后其疼痛表现通常在短时间内消失,但是如果治疗不当会使其病理发生改变进而发展为慢性疼痛。慢性疼痛是现代人类健康和社会发展所面临的主要问题之一。由于其致病原因及发生机制的复杂性在临床上一直都没有较好的解决办法,对患者的身体和心理都带来了严重的危害。因此找到慢性疼痛发病的分子机制是我们现在所面临的重要问题。神经元限制性沉默因子REST/NRSF(Repressor element-1 silencing transcription factor/neuron-restrictive silencing factor,REST/NRSF)是一种具有锌指结构的蛋白质,通过与特异的作用元件NRSE(Neuron-restrictive silencer element,NRSE)相结合,使序列中的组蛋白去乙酰化从而抑制靶基因的转录。REST/NRSF通过与多种辅助因子相互作用不同程度地影响靶基因的表达,其功能受到干扰会导致多种病理状态的产生。有相关研究表明在神经病理性疼痛和骨癌疼痛模型中,REST/NRSF在外周感觉神经元中的表达水平明显升高,相应REST/NRSF靶基因中疼痛相关基因(包括Kcnd3,Kcnq2,Scn10a和Oprm1分别编码Kv4.3,Kv7.2,Nav1.8离子通道和μ-阿片受体)表达同时被抑制。当在鞘内注射REST反义寡核苷酸或si RNA时也能检测到一些转录变化或疼痛行为的减轻。越来越多的证据表明REST/NRSF在慢性疼痛发生发展中发挥重要作用,然而关于痛感觉神经元中REST/NRSF参与慢性疼痛疾病的分子机制仍缺乏系统而深入的认识。为进一步研究相关作用及机制,本论文利用背根神经元特异性敲除REST/NRSF转基因小鼠探讨背根神经元中REST/NRSF参与慢性疼痛疾病的分子机制。论文将分为两部分:第一部分:小鼠背根神经元特异性过表达REST/NRSF对痛觉行为的影响;第二部分:背根神经元特异性敲除REST/NRSF对慢性疼痛痛觉行为的影响。第一部分小鼠背根神经元特异性过表达REST/NRSF对痛觉行为的影响目的:探究在背根神经元(DRG)中过表达REST/NRSF对小鼠痛觉行为的影响。方法:1.采用立体定位技术,精确定位到小鼠的右侧L4背根神经节,使用微量注射器局部给予病毒。实验分为三组:注射生理盐水组,注射AAV2/9-CMV-Null病毒组,注射AAV2/9-CMV-Rest-myc病毒组。给予病毒后1天,7天,14天,21天,24天及28天分别测量三组小鼠机械刺痛和辐射热痛的痛阈;2.采用免疫组织荧光染色技术,检测小鼠注射病毒28天后L4背根神经节和脊髓中REST/NRSF的表达水平。结果:1.术后第1天,第7天,第14天,注射生理盐水组、注射AAV2/9-CMV-Null病毒组、注射AAV2/9-CMV-Rest-myc病毒组小鼠机械刺痛和辐射热痛痛阈没有明显差异;术后第21天,24天,28天注射AAV2/9-CMV-Rest-myc病毒组小鼠与注射生理盐水组小鼠相比机械刺痛和辐射热痛痛阈显著降低(n=10,*P<0.05),注射AAV2/9-CMV-Null病毒组小鼠与注射生理盐水组小鼠相比机械刺痛和辐射热痛痛阈无显著性差异。2.注射AAV2/9-CMV-Rest-myc病毒组小鼠L4背根神经节中约有25%背根神经元检测到外源性REST-myc的表达;注射AAV2/9-CMV-Null病毒组和注射生理盐水组小鼠L4背根神经节中均未检测到外源性REST-myc的表达。注射生理盐水组、注射AAV2/9-CMV-Null病毒组、注射AAV2/9-CMV-Rest-myc病毒组小鼠的脊髓组织均未检测到外源性REST-myc表达。结论:小鼠L4背根神经元过表达REST/NRSF能够引起机械刺痛和辐射热痛痛阈显著降低。第二部分背根神经元特异性敲除REST/NRSF对慢性疼痛痛觉行为的影响目的:探究背根神经元特异性敲除REST/NRSF对神经病理性疼痛和炎性疼痛痛觉行为的影响。方法:1.构建Tamoxifen诱导的背根神经元特异性REST/NRSF敲除小鼠。2.建立CFA炎性疼痛模型,观察和比较对照组小鼠和背根神经元特异性REST/NRSF敲除小鼠机械刺痛与辐射热痛痛阈。3.建立SNI神经病理性疼痛模型,观察和比较对照组小鼠和背根神经元特异性REST/NRSF敲除小鼠机械刺痛痛阈。4.Single cell-PCR技术检测野生型小鼠,对照组小鼠SNI模型以及背根神经元特异性REST/NRSF敲除小鼠SNI模型中小直径背根神经元REST,Kcnd3,Kcnq2,Scn10a和Oprm1的表达水平。结果:1.CFA炎性疼痛模型中,背根神经元特异性REST/NRSF敲除小鼠术侧机械刺痛和辐射热痛痛阈显著高于对照组小鼠(n=6,*P<0.05),对侧机械刺痛和辐射热痛痛阈无显著差别。2.SNI神经病理性疼痛模型中,背根神经元特异性REST/NRSF敲除小鼠术侧机械刺痛痛阈显著高于对照组小鼠(n=6,*P<0.05),对侧机械刺痛痛阈无显著差异。并且野生型小鼠SNI神经病理性疼痛模型背根神经节中REST阳性神经元数量显著增多。3.Single cell-PCR结果显示野生型小鼠SNI神经病理性疼痛模型小直径背根神经元中REST/NRSF表达比例显著升高,REST靶基因Kcnq2和Kcnd3表达比例显著降低(n=89,*P<0.05)。背根神经元特异性REST/NRSF敲除小鼠SNI神经病理性疼痛模型小直径背根神经元中REST表达比例显著降低,同时REST靶基因Kcnq2和Kcnd3表达比例显著升高(n=79,*P<0.05)。结论:1.小鼠背根神经元特异性敲除REST/NRSF能够显著提高CFA炎性疼痛和SNI神经病理性疼痛机械刺痛和辐射热痛痛阈。2.背根神经元特异性敲除REST/NRSF能够有效逆转外周神经损伤所引起REST/NRSF表达水平升高及其靶基因Kcnq2和Kcnd3下调。