前列腺癌是老年男性疾病,为西方国家最常见的肿瘤,死亡率高居第二位。随着人们生活水平的提高,我国的前列腺癌发病率也显著上升。手术治疗、药物治疗、放射治疗和生物治疗是目前疾病治疗的4大疗法,虽然早期手术切除是根治前列腺癌的根本方法,但50%患者在确诊时都已发生远处转移,常规的手术、内分泌及化学疗法均难以明显提高这些患者的生存期。寻找新的治疗前列腺癌的方法迫在眉睫。一氧化氮以其双重的生物学效应在肿瘤研究中得到了普遍的重视,肿瘤细胞产生的低浓度NO促进肿瘤生长,而高浓度NO具有抗肿瘤作用。因此激发肿瘤细胞释放大量的NO可能是一个抗肿瘤的新方法。多种途径可以达到高浓度NO,例如在鼠黑色素瘤和人肾细胞癌细胞中转染iNOS基因,达到了抑制肿瘤发展和转移的效果。NOS基因转移已在大量心血管疾病动物模型和某些人类组织上得到了证实,其表达能有效调节局部血管功能、抑制细胞增殖和迁移、且不干扰全身血液循环,明显优于直接补充外源NO。显示了NOS基因治疗心血管疾病的可能性和优越性。因此内源性和外源性的NOS将会是很有前途的治疗剂或化疗辅助剂,相对其他领域而言,一氧化氮在前列腺癌中生物学效应的研究还有一定的差距。目前国内外尚未见报道将iNOS应用于雄激素非依赖型前列腺癌。我们在前期工作中,通过体外细胞培养,以SNP为外源性NO供体,研究外源性一氧化氮（NO）对前列腺癌细胞增值的影响,并对其作用机制进行了初步探讨。我们认为外源性一氧化氮（NO）对前列腺癌ALAV-31细胞有双重的生物效用:即低浓度的SNP可以促进其生长,该机制可能是通过NO-cGMP途径激活信使传导,也可能在细胞信号传导过程中调节细胞增殖相关基因的表达,从而促进了细胞的生长。而高浓度SNP所释放的NO可以上调p21^waf1/cip1基因,通过其蛋白的表达,使前列腺癌细胞的增殖周期受阻于G1期,抑制细胞的增殖,从而诱导前列腺癌细胞的凋亡。多种方法可以合成分泌高浓度NO,文献多采用NO供体如硝基扩血管药物,作为模拟体内高浓度NO的研究手段,但存在耐药性差、副反应大等缺陷。亦有方案是通过活化淋巴细胞直接调节宿主的免疫应答,这一领域的治疗主要是依赖IFN-α、β、γ和IL-2,由于特异性不强、毒性大等原因大多没有广泛应用。正因为采用药物NO供体或细胞因子刺激产生NO有很多局限性,本研究试图通过基因转染的方法将外源性iNOS导入雄激素非依赖型前列腺癌细胞DU145中,上调细胞内iNOS基因的表达。在iNOS的作用下,细胞内NO的浓度升高,即建立了细胞性NO供体,能持续稳定地释放大量NO,从而干扰细胞的生长周期,诱导细胞发生凋亡。前列腺在解剖位置上的易接近性以及对该病发病机制的认识,使得前列腺癌成为基因治疗的研究热点之一。目前国内外尚无报道将iNOS应用于前列腺癌,因此我们在前期研究的基础上选择研究本课题,我们希望将iNOS应用于前列腺癌基因治疗能为临床有效治疗雄激素非依赖型前列腺癌（AIPC）提供一个新的思路。本课题由三部分组成。目的:将外源性iNOS基因导入前列腺癌细胞内,首先需构建其载体。我们将iNOS基因开放阅读框（open reading frame,ORF）片段与质粒pReceiver-M29连接成重组DNA,扩增制备真核表达载体pReceiver-M29-iNOS（ORF）重组质粒,并进行酶切和测序鉴定,准备转染人雄激素非依赖型前列腺癌细胞株DU145。方法:先用限制性核酸内切酶EcoR I和Xho I酶切质粒pcDNA3.0-iNOS和pReceiver-M29,琼脂糖凝胶回收iNOS（ORF）基因片段和线性化质粒pReceiver-M29,纯化回收产物并连接,将连接产物转化制备好的转化态大肠杆菌DH5α,摇菌扩增,碱裂解法抽取质粒;将提取质粒行酶切鉴定,并进行DNA测序分析,结果与GenBank公布的iNOS cDNA开放阅读框序列比对,BLAST程序分析。结果:扩增抽取的质粒用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切得到预期的6.1kb的pReceiver-M29载体和3.3kb的iNOS cDNA（ORF）片断大小相当的两个条带;测序所得结果与GenBank公布的序列比对,BLAST程序分析提示符合度100%,阅读框架正确。结论:扩增得到了携带有iNOS cDNA开放阅读框全长序列的真核表达载体pReceiver-M29-iNOS（ORF）质粒,阅读框架正确。第二章脂质体介导重组iNOS质粒的转染和DU145细胞的培养筛选目的:在第一阶段,我们利用分子生物学手段构建了iNOS的真核表达载体,在第二阶段,我们将选用雄激素非依赖型前列腺癌细胞DU145细胞株作为研究和转染的对象,获得稳定表达iNOS的雄激素非依赖型前列腺癌DU145细胞阳性克隆,进而用于进行细胞的后续研究。方法:5%CO₂,37℃条件下,DU145细胞培养于10%新生牛血清的DMEM培养基。按阳离子脂质体Lipofectamine 2000说明操作,用重组pReceiver-M29-iNOS（ORF）质粒和空载体质粒pReceiver-M29转染DU145细胞,分组A为转染pReceiver-M29-iNOS质粒组、B为转染pReceiver-M29空载体组、C为对照Control组。抗生素G418以400～700μg/ml筛选压力筛选2周,第3周挑取细胞单克隆并在400μg/ml浓度的G418中继续培养扩增。Trizol法抽提3组细胞的总RNA,RT-PCR以一步法逆转录制备cDNA及PCR反应,产物1%琼脂糖凝胶电泳观察摄片,片段回收并送测序。倒置、荧光显微镜观察各组细胞形态。结果:转染10天后,对照组DU145细胞全部死亡,14天后转染pReceiver-M29-iNOS质粒组、转染pReceiver-M29空载体组始呈克隆状生长,21天挑出单克隆继续培养扩增。3组细胞抽提RNA,逆转录制备cDNA,PCR反应,β-actin为内参,琼脂糖凝胶电泳,显示转染pReceiver-M29-iNOS质粒组出现与设计片段大小相当的条带,而另两组则无。荧光显微镜下观察,转染pReceiver-M29-iNOS质粒组、转染pReceiver-M29空载体组细胞可见绿色荧光。结论:本部分成功建立了稳定表达iNOS的DU145细胞阳性克隆。目的:在证实成功建立了稳定表达iNOS的雄激素非依赖型前列腺癌DU145细胞阳性克隆并进行细胞培养扩增后,我们将探讨转染iNOS基因后,前列腺癌DU145细胞的生长和增殖、凋亡是否会受到影响。方法:5%CO2,37℃条件下,转染pReceiver-M29-iNOS质粒组、转染pReceiver-M29空载体组、对照Control组DU145细胞培养于10%新生牛血清的DMEM培养基。倒置显微镜下观察各组细胞的形态;分别用流式细胞仪检测各组细胞凋亡;细胞计数法、MTT法绘制细胞生长曲线;观察使用NOS抑制剂对转染细胞的影响。结果:倒置显微镜下观察,DU145细胞转染iNOS后生长状态变差,形态学恶性表型减轻,流式细胞仪提示转染iNOS组凋亡增加。生长实验显示转染pReceiver-M29-iNOS质粒组细胞生长较两对照组减慢（P<0.05）,NOS抑制剂可以加快其生长,但差异不具有显著性（p<0.05）。结论:转染iNOS基因的DU145细胞能够分泌高浓度的NO,转染iNOS基因后,能够诱导前列腺癌DU145细胞凋亡,抑制前列腺癌DU145细胞的生长,为雄激素非依赖型前列腺癌（androgenindependent prostate cancer,AIPC）的治疗开辟一条新的途径,为下一步的研究奠定了基础。本研究中我们成功构建了pReceiver-M29-iNOS（ORF）重组质粒载体。证实构建完成的重组pReceiver-M29-iNOS（ORF）质粒载体符合实验目的,具备可进行细胞转染和易被识别筛选的穿梭质粒的特点及要求。然后我们采用脂质体Lipofectamine2000介导重组pReceiver-M29-iNOS质粒成功地完成了对前列腺癌DU145细胞的稳定高效转染过程,通过G418筛选获得了足够数量的整合了重组pReceiver-M29-iNOS质粒的单克隆的雄激素非依赖性前列腺癌DU145细胞的阳性克隆细胞系统。转染iNOS基因的DU145细胞能够分泌高浓度的NO,转染iNOS基因后,能够诱导前列腺癌DU145细胞凋亡,抑制前列腺癌DU145细胞的生长。在肿瘤研究中最简单的模型就是体外培养肿瘤细胞,现代培养技术己经能够满足需要。尽管细胞系的研究工作可以部分阐明肿瘤发生机制、生物学行为等某些肿瘤生物学性状的重要信息,但其生长环境与体内不尽相同,且由于选择性生长等因素,导致其研究结果具有一定的局限性。因此将iNOS应用于前列腺癌仍然有不少问题有待进一步探索,我们将继续研究,相信基因治疗将为最终征服前列腺癌带来革命性的突破。