柑桔黄龙病(Citrus huanglongbing, HLB)以前也叫青果病。这是一种可以使得柑桔减产、破坏果品经济价值甚至造成柑桔植株死亡的毁灭性柑桔病害。该病害主要通过嫁接或者木虱媒介传播,现在广泛分布于亚洲各国、印度次大陆及印度洋地区、非洲南部和最近报道的美国、巴西。病原微生物是一种生活在病株筛管组织以及媒介昆虫体内的原核生物,在分类上属于薄壁菌门(Proteobacteria)的α-亚纲。根据环境条件与媒介昆虫等的不同可以将HLB分成三种:由亚洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,Las)引起并由亚洲柑桔木虱(Diaphorina citri)传播的是一种耐热型HLB;由非洲韧皮部杆菌(Ca. L. africanus, Laf)引起并由非洲木虱(Trioza erytreae)传播的是一种热敏感型HLB;由美洲韧皮部杆菌(Ca. L. americanus, Lam)引起并由亚洲柑桔木虱(D. citri)传播的是另一种耐热型HLB。病原细菌至今没有获得纯培养物,同时也没有通过科赫氏鉴定。由于缺乏有效的杀菌剂和柑桔抗性品种,因此现在很多国家都是通过挖除、焚毁病树或者加强检验检疫的方法来阻止HLB的入侵和定植。在整个检验检疫、移除病树乃至建设无病害苗圃等综合应对体系中,一种准确、快速、稳定的检测方法都是必需的。我研究工作的第一部分就是开发一种满足上述要求的检测体系:首先优化并建立了两套荧光定量PCR(RTi-PCR)体系——TaqMan探针法和SYBR Green I荧光染料法,其中引物CQULA04F/CQULA04R和探针CQULAP1是根据亚洲韧皮部杆菌种特异的核糖体蛋白基因rplJ/rplL设计并筛选的;然后通过与以前建立的HLB常规PCR检测体系比较证实两套RTi-PCR体系的检测性能(包括灵敏度、特异性和稳定性)均优于前者,并且发现TaqMan探针法体系特异性最好,灵敏度比SYBR Green I染料法稍低。这种经过优化的分子检测方法可以用于HLB的早期诊断、亚洲韧皮部杆菌的监测和鉴别以及田间病害流行学方面的研究。荧光定量PCR的重要性不仅体现在其用于检测时超高的灵敏度、特异性和稳定性,还在于她是一种即使没有获得HLB病原物纯培养也能帮助我们探索HLB未知领域的定量研究方法。由于TaqMan探针法与SYBR Green I染料法相比具有更好的稳定性和特异性,因此它成为我第二部分定量研究工作的主要工具。对HLB的定量研究获得了以下结果:①HLB病原菌在柑桔病树体内不均匀的分布情况;②叶片部位病原菌数量在一年间的动态变化情况;③各种典型症状用于田间诊断的可靠性;④带毒媒介木虱的危险程度在一年间的动态变化;⑤通过解剖研究得到的关于木虱传毒机制的一个模型。上述定量研究结果支持了很多先前的研究者获得的结果或假说,如症状诊断的可靠性问题;但是也有一些对先前的观念提出了挑战,例如以前认为HLB病原菌在木虱体内并不繁殖,然而定量研究的结果显示木虱个体含菌量之间高达百万倍的差异是很难在上述观点下成立的。根据“第二届国际柑桔溃疡病和黄龙病研讨会”(Florida,2005)的建议,未来柑桔HLB的研究热点与方向应集中在以下15个方面:经济学、其它寄主研究、病害和媒介检测、HLB分类特征、抗性育种、HLB病原纯培养、病原/媒介/寄主相互关系、化学防治、生物防治、栽培防治、病害流行学、转基因、基因组学、媒介生物学、果实收成与品质。本研究涉及了其中至少4个方面的工作:分子检测方法(病害和媒介检测)、柑桔近缘种抗性评价(抗性育种)、柑桔和木虱中病原菌的定量研究(病原/媒介/寄主相互关系)、媒介昆虫对病害流行的影响(病害流行学)。然而本研究能够产生的实际影响应该是更为深远的。