【摘 要】
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尿素ABC-转运体透性酶亚基编码基因urtB可能参与尿素代谢及支链氨基酸转运;本文旨在获得实验证据阐明urtB对华癸根瘤菌结瘤和固氮的影响,为深入研究其功能机制提供一定的科学依据。本研究利用生物信息学分析urtB蛋白的结构特征及生物学功能,通过荧光定量检测urtB在自生和共生条件下的时空表达特征和启动子原位表达技术检测urtB组织表达特征,采用插入突变构建urtB突变株,构建了urtB突变株的互补
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尿素ABC-转运体透性酶亚基编码基因urtB可能参与尿素代谢及支链氨基酸转运;本文旨在获得实验证据阐明urtB对华癸根瘤菌结瘤和固氮的影响,为深入研究其功能机制提供一定的科学依据。本研究利用生物信息学分析urtB蛋白的结构特征及生物学功能,通过荧光定量检测urtB在自生和共生条件下的时空表达特征和启动子原位表达技术检测urtB组织表达特征,采用插入突变构建urtB突变株,构建了urtB突变株的互补菌株,通过植物盆栽并结合添加氮素处理,检测与分析突变体、互补菌株的共生固氮表型变化。分析表明urtB基因对于氮素转运非常重要,在共生条件下的表达水平比自生培养条件下显著上调表达;在成熟根瘤的固氮区中大量表达;正确构建和筛选获得了根瘤菌urtB突变株;接种urtB突变株与野生型菌株7653R相比较,突变体根瘤发育异常;植株地上部分生物量和根瘤固氮酶活性显著降低;添加氮素可恢复其共生缺陷表型。华癸中慢生根瘤菌urtB基因可能通过影响根瘤中氮转运或同化,进而在根瘤发育与共生固氮中发挥重要作用。在前期工作中,利用酵母双杂交系统筛选和鉴定出一个与紫云英类受体激酶AsNip43互作的候选靶蛋白AsEPN。生物信息学预测分析发现AsEPN含有一个ENTH/ANTH蛋白超家族结构域。本文对AsEPN在紫云英共生固氮中的功能表型进行了鉴定和确证。同时,再次利用酵母双杂交技术筛选紫云英cDNA文库,以期获得新的AsNip43互作蛋白。主要结果如下:利用Real-time PCR检测了AsEPN的时空表达和组织特异性表达,确证了该基因与共生固氮作用密切相关;克隆了AsEPN全长,通过构建目标基因的超表达及沉默载体,获得超表达和沉默复合菌株;通过植株长势、根瘤切片及根瘤固氮酶活等多个指标,检测AsEPN沉默和超表达后的共生固氮表型;构建了p1301-eGFP-Flag-EPN载体,检测了 AsEPN蛋白在烟草及紫云英毛根中的定位。初步阐明该基因在共生固氮中的功能表型。另外,本文还筛选获得一个含有WHy结构域的新互作蛋白基因AsWHy,利用Real-time PCR检测了 AsWHy的时空表达特征。上述结果为阐明AsNip43的功能机制提供了工作基础和新线索。
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