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铁硫(Fe-S)蛋白在铁-氧传感器,酶和基因表达调控中起着至关重要的作用。NEET蛋白属于独特的铁硫(Fe-S)蛋白家族,可调节铁和活性氧的体内稳态,并参与癌症、糖尿病、神经变性和衰老的进程。在人类线粒体中,NEET蛋白包括:mitoNEET(mNT),营养剥夺自噬1(NAF-1)和线粒体内NEET蛋白(Miner2)。mNT是结合抗2型糖尿病吡格列酮药物的蛋白,NAF-1蛋白的表达抑制会导致寿命缩短,NAF-1和mNT的骨架折叠与植物的同型二聚体NEET蛋白(At-NEET)相似。尽管发现Miner2蛋白在肺癌,乳腺癌和其他类型的癌症中高表达,但Miner2蛋白在线粒体中的功能了解甚少,所以本文研究Miner2蛋白的相关性质。首先,Miner2蛋白表达与纯化。利用分子生物学方法,将重组质粒pET22b-Miner2(Δ35)转入大肠杆菌(E.coli)BL21中,经IPTG(0.3 mM)诱导获得了该蛋白的可融性表达,经Ni-NTA亲和层析、CM阳离子交换层析多步纯化后,得到了比较纯的目标蛋白。为该蛋白的化学性质研究准备了必要的材料。其次,Miner2蛋白[2Fe-2S]簇稳定性研究。通过紫外-可见光谱方法研究了pH值、离子强度以及温度对Miner2蛋白[2Fe-2S]簇的稳定性。结果发现pH值的变化对Miner2蛋白[2Fe-2S]簇稳定性影响最为明显;该[2Fe-2S]簇在pH为8的溶液中稳定性最佳,而提高溶液的离子强度、降低溶液温度均有利于提高Miner2蛋白[2Fe-2S]簇的稳定性;另外,[2Fe-2S]簇不再与Miner2蛋白氨基酸配位后,脱落的[2Fe-2S]簇在溶液中很快分解为离子形态Fe3+和S2-。第三,对Miner2蛋白[2Fe-2S]簇氧化还原性的研究。Miner2蛋白Fe-S簇中Fe(III)、S荷移峰在458 nm,Fe(II)、S荷移峰在420 nm。Miner2蛋白中加入H2O2时,其峰位置仍在458 nm,表明Miner2蛋白中Fe为三价。Miner2蛋白的三价铁可以被连二亚硫酸钠(Na2S2O4)完全还原为二价铁,紫外光谱的特征吸收峰在420 nm;二硫苏糖醇(DTT)还原Miner2蛋白后,紫外吸收峰在443 nm,也就说明三价铁只能部分被还原;而抗坏血酸(VC),还原型谷胱甘肽(GSH)不能还原Miner2蛋白,458 nm处峰没有发生变化。同时也证明了Miner2蛋白[2Fe-2S]簇的氧化还原是可逆的。在Hepes缓冲中,因为质子耦合电子转移,推测[2Fe-2S]簇发生Fe3++H++e→Fe2++H·转化。最后,通过疏水荧光探针(TNS)研究了[2Fe-2S]对Miner2蛋白构象变化的影响。实验结果表明Miner2蛋白与TNS的结合比为1:2,结合常数K=1.3×105 M-1,两个TNS与Miner2蛋白的Trp60之间的能量转移效率E=0.53,距离为r=1.58 nm。Miner2蛋白丢失铁硫簇后,Apo-Miner2蛋白与TNS的结合比为1:1。Miner2蛋白构象发生了改变,伴随着蛋白疏水结构的减少。