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研究背景:小肠是人体最为重要的消化器官。肠粘膜屏障在维持人体的正常营养代谢和细菌稳态平衡中发挥着重要作用。我们的前期研究发现证实了水通道蛋白3(aquaporins-3,AQP3)在肠粘膜上皮细胞中的表达对于维持肠粘膜屏障的完整性起到了关键作用。而过表达微小RNA-874(microRNA-874,miRNA-874)后可以通过干扰AQP3的转录后表达,进而影响肠粘膜屏障的功能。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一组长度在200-100000nt之间的RNA分子,起初被认为是基因组转录的“噪音”。然而,近年来的研究表明,lncRNA可以作为内源竞争性RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)通过碱基对完全或部分配对互补相关miRNA的成熟体,抑制miRNA沉默复合体(RISC-miRNA)对下游mRNA的降解和翻译抑制作用,从而达到对蛋白转录后调控的作用。基于以上研究背景和前期研究结果,我们推测和假设是否存在一种或多种潜在的lncRNA可以通过ceRNA机制对miRNA-874进行调控,从而建立AQP3的表达进行转录后调控机制,进而影响小肠粘膜屏障的功能。研究方法:在研究的第一部分,我们首先采用生物信息学软件分析预测可能通过ceRNA机制特异性吸附miRNA-874的lncRNA,预测结果发现lncRNA H19的第1603-1609 BP位置的存在7个碱基与miRNA-874存在互补配对的关系。接着我们采用RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP)和荧光素酶报告基因实验验证两者的相互作用关系。采用慢病毒转染的方法,分别过表达/干扰Caco-2细胞中lncRNA H19表达与miRNA-874的表达水平后,采用细胞免疫荧光实验、Western-blot 和qRT-PCR技术检测Caco-2细胞中lncRNA H19、miRNA-874和AQP3的表达水平。在研究的第二部分,我们首先采用免疫组化、Western-blot和qRT-PCR技术分别检测人小肠粘连,肠梗阻病变小肠粘膜组织、鼠小肠缺血再灌注损伤模型和体外细胞缺血、缺氧模型中lncRNAH19、miRNA-874和AQP3表达水平的变化模式及其变化水平的相关性。接着我们采用不同lncRNA H19、miRNA-874表达水平的稳转染Caco-2细胞株构建了单层细胞模型用以模拟人肠粘膜屏障。检测不同单层细胞模型不同时期的单层细胞模型跨膜电阻(TEER)、荧光黄透过率(LY permeability)和大肠杆菌(E.coli)易位率。最后我们通过Western-blot实验检测了过表达/干扰lncRNA H19后Caco-2细胞中紧密联接相关蛋白的表达变化。研究结果:1.生物信息学分析发现lncRNA H19的第1603-1609 BP位置的存在7个碱基与miRNA-874存在互补配对的关系,并能够通过碱基配对方式特异性“吸附”miRNA-874。RIP实验结果和荧光素酶活性实验结果证实了lncRNA H19与miRNA-874两者的相互作用关系。2.细胞免疫荧光和Westem-blot结果提示在Caco-2细胞中过表达lncRNA H19可导致AQP3蛋白表达水平的上调,而干扰lncRNA H19可导致AQP3蛋白表达水平的下调。LncRNA H19与AQP3的表达水平的正相调控关性可以通过过表达或干扰miRNA-874进行逆转和回复。3.Westem-blot和qRT-PCR结果提示:在39对肠粘连、肠梗阻患者病变肠管的患侧粘膜组织中的AQP3、lncRNA H19表达水平明显低于健侧粘膜,miRNA-874表达水平明显高于健侧粘膜。4.小鼠小肠缺血再灌注损伤模型中小肠粘膜组织中的AQP3、lncRNAH19表达水平随缺血再灌注损伤时间延长呈逐渐下降趋势,而miRNA-874表达水平呈逐渐上升降趋势。5.Caco-2细胞在无血清/缺氧培养后,细胞株中AQP3、lncRNA H19表达水平随培养时间延长呈逐渐下降趋势,miRNA-874表达水平呈逐渐上升趋势。6.LncRNA H19过表达组的Caco-2单层细胞模型与阴性对照组相比细胞跨膜电阻有所升高,荧光黄透过率和大肠杆菌易位率有所下降;LncRNA H19干扰组单层细胞模型与阴性对照组相比细胞跨膜电阻明显下降,荧光黄透过率和大肠杆菌易位率有所上升。7.通过干扰/过表miRNA-874,可以回复和逆转lncRNAH19对Caco-2单层细胞模型细胞跨膜电阻的正向调控和对荧光黄透过率、大肠杆菌易位率的负向调控。8.Westem-blot结果显示:lncRNA H19过表达组Caco-细胞株中调紧密连接相关蛋白claudin-1的表达水平明显高于阴性对照组,lncRNA H19干扰组Caco-细胞株中调紧密连接相关蛋白claudin-1和occludin表达水平明显低于阴性对照组。研究结论:本研究初步证实了 lncRNA H19可以通过ceRNA机制竞争性吸附miRNA-874进而抑制miRNA-874对AQP3蛋白表达的转录后负向调控作用。LncRNA H19表达水平的下调是肠粘膜功能障碍时的一个重要分子变化特征。肠粘膜屏障中lncRNA H19下调可能导致其对miRNA-874的竞争吸附能力下降,进而导致AQP3的表达水平下调,最终导致肠粘膜屏障通透性增加,紧密连接损伤以及肠粘膜屏障功能障碍的发生。