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为了研究血凝素和神经氨酸酶的匹配性对H5N6亚型禽流感病毒生物学特性的影响,本研究采用流感病毒反向遗传操作系统,利用本课题组已建立的A/Goose/Guangdong/SH7/2013(H5N1)反向遗传系统的6个内部片段为骨架,A/Duck/Guangdong/673/2014(H5N6)(简称673)流感病毒提供HA基因,A/Goose/Guangdong/674/2014(H5N6)(简称674)提供HA基因和NA基因,重组了2株H5N6亚型禽流感病毒,分别命名为r673HA674NA和r674HA674NA,之后通过一系列体内体外试验评估HA-NA匹配性对病毒生物学特性的影响。测序结果表明:673HA与674HA存在14个氨基酸位点差异,但2个毒株HA的潜在糖基化位点都一致,之后用唾液酸受体结合能力试验测定2个毒株的唾液酸受体结合能力,结果表明2株重组禽流感病毒都是以结合α-2,3唾液酸受体为主,其中r674HA674NA对α-2,3唾液酸受体结合能力强于r673HA674NA,但2株重组禽流感病毒对α-2,6唾液酸受体结合能力基本一致。体外蚀斑试验、红细胞解凝试验和病毒在细胞中的增殖试验结果表明:r673HA674NA重组禽流感病毒在MDCK细胞上形成的蚀斑显著大于r674HA674NA,在豚鼠红细胞解凝试验中,r673HA674NA重组禽流感病毒HA孔数减少了11孔,而r674HA674NA重组禽流感病毒HA孔数仅减少了1孔,表明r673HA674NA重组禽流感病毒在豚鼠红细胞中更易解离,并且在CEF细胞和MDCK细胞的增殖试验中,r673HA674NA重组禽流感病毒在接毒后12-60h复制滴度都高于r674HA674NA,表明r673HA674NA重组禽流感病毒在CEF细胞和MDCK细胞的增殖也显著好于r674HA674NA,这些结果都说明r673HA674NA重组禽流感病毒HA-NA的匹配性好于r674HA674NA重组禽流感病毒。在体内试验中,本研究测定了2株重组禽流感病毒对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性,结果表明:r673HA674NA和r674HA674NA2株重组禽流感病毒对SPF鸡的致病性都是强致病性,以105EID50/200u L攻毒后,SPF鸡可在3天内死亡,但HA-NA的匹配性好的r673HA674NA重组禽流感病毒比r674HA674NA重组禽流感病毒在鸡群中的接触传播能力更强,r673HA674NA重组禽流感病毒同居组死亡率为72%,而r674HA674NA重组禽流感病毒同居组死亡率为57%,r673HA674NA重组禽流感病毒在攻毒后第2天和第4天检测的拭子排毒量也更高,能在鸡群中引起的危害更大。r673HA674NA重组禽流感病毒对BALB/c小鼠的MLD50更大,r673HA674NA重组禽流感病毒的MLD50为4.5,而r674HA674NA重组禽流感病毒MLD50为3.2,r673HA674NA重组禽流感病毒对小鼠的致病性更弱,在肺脏的复制滴度也更低,表明BALB/c小鼠并不是一个好的评价H5N6亚型禽流感病毒HA-NA匹配性的动物模型。这也与之前的报道研究结果相一致。其中可能的原因是在小鼠的呼吸道上皮细胞是以α-2,3唾液酸为主,而r674HA674NA重组禽流感病毒具备更强的结合α-2,3唾液酸受体的能力,使得病毒能够更好的在呼吸道中增殖,对BALB/c小鼠产生更强的致病性。同时2株重组禽流感病毒HA的受体结合区域氨基酸的组成不同也可能是导致r674HA674NA重组禽流感病毒对BALB/c小鼠致病性更强的原因。