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漆酶(laccase)是一种含铜的多酚氧化酶，具有广泛的底物谱，能够氧化多种有机物质，在有机农药残留和木质素的降解方面具有潜在的工业价值。
本研究从特异腐质霉Y1（Humicola insolens Y1）中分离到了漆酶基因lac1，其全长1803bp，编码600个氨基酸，与NCBI蛋白数据库比对结果表明，与来源于Chaetomium globosum CBS148.51(XP_001228806)的多酚氧化酶序列相似性最高为71％，表明是一个新的漆酶基因。将lac1基因克隆入大肠杆菌表达载体pET30a时，构建重组表达载体pET30a-lac1，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，重组酶并没有表现出酶活，且为不溶性表达，经优化培养条件，结果显示酶活没有提高，未改善可溶性表达的情况;将lac1的基因片段克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9中，构建重组表达载体pPIC9-lac1，酶活测定结果和SDS-PAGE检测证实基因已经整合入酵母基因组中且能分泌表达。在3L发酵罐中发酵培养，Lac1蛋白表达量达到3.79mg/mL发酵液，酶活性达到1.3U/mL发酵液，是摇瓶发酵酶活结果的10倍。酶学性质分析结果显示，漆酶的最适作用温度为65℃，最适反应pH值为4.5，且在pH6-11的范围内酶的相对活力均在70％以上。为从真菌中发掘酶学性质优良的新的漆酶奠定了基础。
为了提高地衣芽孢杆菌来源漆酶CotA的表达水平，本文从稀有密码子的同义突变方向对目标基因自身进行了优化。通过改善序列中精氨酸的密码子使用，将cotA基因中的使用精氨酸稀有密码子的位点进行密码子的同义突变，将CGT/CGA突变为CGA/CGT。cotA基因序列的第534/747/1317/1533位的T突变为A，以及第738/918位的A突变为T，同时将这些突变体基因克隆入表达载体pET30a，并转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达，测定漆酶酶活，与野生型相比，第534位点突变体的酶活下降，第738位点的突变酶活没有改变，其它的突变体酶活均有所提高，突变位点越接近基因的C端酶活越高，最末尾的第1533位点突变体的酶活是野生型的2倍。为提升漆酶的表达量提供了新思路。
此外，有报道称分子伴侣可以改善外源蛋白的分泌表达情况，为了改善毕赤酵母中漆酶的表达，将能够影响外源蛋白表达及分泌的分子伴侣与漆酶基因共表达。本研究中在已有报道的分子伴侣中筛选出8种功能型分子伴侣基因(GCN4/SSE1/SEC53/KIN2-1/KIN2-2/BMH2/HAC1/PDI)，分别克隆入载体pGAPZA或者pPICZA上，分别构建了10种重组载体（pGAPZA-GCN4/SSE1/SEC53/KIN2-1/KIN2-2/BMH2/HAC1和pPICZA-GCN4/BMH2/PDI）。转入本实验室已成功构建的含有漆酶基因cueo的酵母菌株GS115/pPIC9-cueo中实现共表达，获得10种重组工程菌株，在培养的过程中，分别共表达载体pPICZA-GCN4/BMH2/PDI的菌株转化子多且有酶活，其它菌株转化子较少，并且没有检测到酶活。将有酶活的菌株发酵培养，并测定培养上清的酶活性，结果显示共表达分子伴侣BMH2和PDI的漆酶酶活分别提高了80％和20％。为提升漆酶的表达量提供了新思路。
本研究首先筛选到了一株新的漆酶基因，并发现了该酶的最适温度、最适pH及稳定性的酶学性质，另外还得到了两种能够提高漆酶表达量的思路，一方面可以通过突变漆酶中精氨酸的稀有密码子，另一方面可以通过与分子伴侣共表达。为漆酶的应用奠定基础。
本研究从特异腐质霉Y1（Humicola insolens Y1）中分离到了漆酶基因lac1，其全长1803bp，编码600个氨基酸，与NCBI蛋白数据库比对结果表明，与来源于Chaetomium globosum CBS148.51(XP_001228806)的多酚氧化酶序列相似性最高为71％，表明是一个新的漆酶基因。将lac1基因克隆入大肠杆菌表达载体pET30a时，构建重组表达载体pET30a-lac1，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，重组酶并没有表现出酶活，且为不溶性表达，经优化培养条件，结果显示酶活没有提高，未改善可溶性表达的情况;将lac1的基因片段克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9中，构建重组表达载体pPIC9-lac1，酶活测定结果和SDS-PAGE检测证实基因已经整合入酵母基因组中且能分泌表达。在3L发酵罐中发酵培养，Lac1蛋白表达量达到3.79mg/mL发酵液，酶活性达到1.3U/mL发酵液，是摇瓶发酵酶活结果的10倍。酶学性质分析结果显示，漆酶的最适作用温度为65℃，最适反应pH值为4.5，且在pH6-11的范围内酶的相对活力均在70％以上。为从真菌中发掘酶学性质优良的新的漆酶奠定了基础。
为了提高地衣芽孢杆菌来源漆酶CotA的表达水平，本文从稀有密码子的同义突变方向对目标基因自身进行了优化。通过改善序列中精氨酸的密码子使用，将cotA基因中的使用精氨酸稀有密码子的位点进行密码子的同义突变，将CGT/CGA突变为CGA/CGT。cotA基因序列的第534/747/1317/1533位的T突变为A，以及第738/918位的A突变为T，同时将这些突变体基因克隆入表达载体pET30a，并转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达，测定漆酶酶活，与野生型相比，第534位点突变体的酶活下降，第738位点的突变酶活没有改变，其它的突变体酶活均有所提高，突变位点越接近基因的C端酶活越高，最末尾的第1533位点突变体的酶活是野生型的2倍。为提升漆酶的表达量提供了新思路。
此外，有报道称分子伴侣可以改善外源蛋白的分泌表达情况，为了改善毕赤酵母中漆酶的表达，将能够影响外源蛋白表达及分泌的分子伴侣与漆酶基因共表达。本研究中在已有报道的分子伴侣中筛选出8种功能型分子伴侣基因(GCN4/SSE1/SEC53/KIN2-1/KIN2-2/BMH2/HAC1/PDI)，分别克隆入载体pGAPZA或者pPICZA上，分别构建了10种重组载体（pGAPZA-GCN4/SSE1/SEC53/KIN2-1/KIN2-2/BMH2/HAC1和pPICZA-GCN4/BMH2/PDI）。转入本实验室已成功构建的含有漆酶基因cueo的酵母菌株GS115/pPIC9-cueo中实现共表达，获得10种重组工程菌株，在培养的过程中，分别共表达载体pPICZA-GCN4/BMH2/PDI的菌株转化子多且有酶活，其它菌株转化子较少，并且没有检测到酶活。将有酶活的菌株发酵培养，并测定培养上清的酶活性，结果显示共表达分子伴侣BMH2和PDI的漆酶酶活分别提高了80％和20％。为提升漆酶的表达量提供了新思路。
本研究首先筛选到了一株新的漆酶基因，并发现了该酶的最适温度、最适pH及稳定性的酶学性质，另外还得到了两种能够提高漆酶表达量的思路，一方面可以通过突变漆酶中精氨酸的稀有密码子，另一方面可以通过与分子伴侣共表达。为漆酶的应用奠定基础。