论文部分内容阅读
胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是一种致命的恶性肿瘤,约90%以上的胰腺癌均属于此类型,其发病隐匿,进展迅速。手术后的平均存活期一般不足2年,5年生存率仅为8%左右。因此,迫切需要对PDAC的分子机制,做更深入研究,开发更有效的治疗措施和药物。
近几年研究发现,同乙酰化、磷酸化一样,蛋白质的甲基化也在癌症进展中发挥重要作用。精氨酸甲基转移酶5(Protein arginine methyltransferase enzyme5,PRMT5)是蛋白质精氨酸甲基转移酶家族(PRMTs)的重要成员,能够对称双甲基化多种组蛋白和非组蛋白。已知PRMT5在多种类型癌症中呈高表达,促进癌症进展,但在PDAC中的作用尚不清楚。本研究首先比较了人正常胰腺组织和胰腺癌组织样品、以及正常胰腺(Human pancreatic nestin expressing cells,HPNE)细胞和PDAC细胞(PANC-1,MiaPaCa2)中PRMT5的表达量。通过PCR扩增PRMT5片段,克隆获得慢病毒质粒,制备相应慢病毒,并分别感染PANC-1细胞,制备低表达和高表达PRMT5的PANC-1稳定细胞系和相应对照细胞系。在此基础上,研究PRMT5表达量对于PANC-1细胞的生物学影响,如NF-κB双荧光素酶实验检测NF-κB通路活性,qRT-PCR检测NF-κB下游相关基因(TNF-α和IL-8)的表达,CCK-8检测癌细胞的增殖能力,Transwell实验检测癌细胞的侵袭能力。
鉴于NF-κB通路在正常细胞中也发挥重要功能,所以直接抑制NF-κB活性不是最思想的PDAC治疗方法,如能够通过抑制PRMT5的表达或其酶活性,从而间接抑制NF-κB活性,则较为理想,为此,本研究进一步探求能够特异性抑制PRMT5的microRNAs(miRNAs)或药物。
miRNAs是一类保守、非编码的微小RNA,通过种子序列和靶基因互补配对,结合到相应的靶基因上,从而降解靶基因mRNA或抑制其翻译,在转录后水平调控基因表达。研究发现,许多miRNAs都参与PDAC疾病过程中。且另有报道在多种类型癌症中,miRNAs能够靶向抑制PRMTs的表达,从而改善疾病进展。但截至目前,在PDAC中,尚无文献报道两者是否存在相互作用。因此,本研究首先利用miRNA-seq实验,筛选受PRMT5表达量影响的miRNAs,结合使用预测软件TargetScan进一步分析、筛选出miR-485-5p作为研究对象。将miR-485-5p mimics及阴性对照NC分别转染至PANC-1细胞后,qRT-PCR检测miR-485-5p表达量,验证转染是否成功。再分别检测PRMT5的mRNA和蛋白表达量变化。并检测miR-485-5p对NF-κB活性和下游相关基因(TNF-α和IL-8)的表达量,以及对癌细胞增殖和侵袭的影响。并利用双荧光素酶报告系统检测PRMT53-UTR是否为miR-485-5p的靶基因,通过突变实验和回复实验进一步验证。
另外,除了利用miRNAs抑制PRMTs的表达,开发或筛选能够抑制PRMTs酶活性的抑制剂,也是一种有效的疾病治疗方法。本文通过纯化PRMT5蛋白,建立和鉴定均相光激化学发光免疫分析技术(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay,AlphaLISA)方法,并选用含美国FDA批准的药物文库,进行药物高通量筛选。由于一些药物本身具有颜色,为了去除假阳性结果,进行了淬火实验,最终筛选到坎地沙坦。采集其处理或未处理PANC-1细胞样品,Western Blot(WB)检测了其对PRMT5的酶活性影响。并测定了其在HPNE和PANC-1细胞中的IC50。以及对NF-κB活性和下游相关基因(TNF-α和IL-8)的表达量、癌细胞非贴附性生长和3D克隆形成、小鼠体内肿瘤生长的影响。本课题研究结果显示了PRMT5在PDAC中的促癌机制,并且筛选到抑制其表达或酶活性的miRNAs和药物,为PDAC的治疗提供了新的方案和参考。
1.主要研究结果:
1.1、PRMT5蛋白在PDAC样品中高表达。
免疫组化和WB结果显示:相对于正常人胰腺组织和HPNE细胞,PRMT5蛋白在PDAC组织和细胞系(PANC-1,MiaPaCa2)中表达量更高。
1.2、建立高或低表达PRMT5的PANC-1稳定细胞系后,发现PRMT5在PDAC中发挥促癌作用。
通过人为构建pLVX-PRMT5重组质粒,并制备和利用相应慢病毒(pLVX-PRMT5、pLVX-control,以及shscramble、shPRMT5)进行一系列实验。如NF-κB通路活性检测、qRT-PCR、CCK-8实验和Transwell实验结果显示,相比于对照组pLVX-control细胞,在pLVX-PRMT5细胞中,NF-κB通路活性升高,TNF-α和IL-8基因表达水平也显著升高,癌细胞增殖和侵袭能力显著增强;反之,在shPRMT5细胞中结果呈现相反趋势。
1.3、筛选到抑制PRMT5表达的miR-485-5p,其抑制PDAC进展。
通过miRNA-seq实验,并利用TargetScan预测软件,分析、筛选出miR-485-5p作为研究对象。将miR-485-5p mimics及阴性对照(NC)分别转染至PANC-1细胞后,相比于NC对照组,在过表达miR-485-5p的PANC-1细胞中,NF-κB活性、TNF-α和IL-8基因的表达量、癌细胞增殖和侵袭能力显著降低。
1.4、miR-485-5p靶向结合PRMT53-UTR,从而抑制PRMT5的表达。
qRT-PCR和WB结果显示,miR-485-5p能够抑制PRMT5的mRNA和蛋白表达水平。双荧光素酶活性实验和突变实验、回复实验结果显示,miR-485-5p通过种子序列靶向结合PRMT53-UTR,从而达到抑制作用。
1.5、筛选到抑制PRMT5酶活性的坎地沙坦,其抑制PDAC进展。
本研究通过纯化PRMT5蛋白,建立AlphaLISA方法。并检测方法的高通量性,淬火实验去除假阳性结果,最终筛选出药物:坎地沙坦(candesartan cilexetil)。
药物毒力检测结果显示,相比于在PANC-1细胞(IC50=18μM)中药效,坎地沙坦在HPNE细胞(IC50=70μM)中呈现低毒力,具有潜在应用价值。相比于未处理组,在经坎地沙坦处理的细胞中,PRMT5甲基化产物p65-R30me2蛋白表达水平显著下降,NF-κB活性发生药物浓度依赖性下降,TNF-α和IL-8基因表达水平下降。PANC-1细胞的非贴附性生长能力和3D克隆形成能力也呈现浓度依赖性下降;PDAC小鼠体内肿瘤生长实验结果显示,在未影响小鼠体重情况下,相比于对照组,不同剂量的坎地沙坦(10mg/kg、20mg/kg)均能抑制PDAC小鼠体内肿瘤的生长,当药物浓度为20mg/kg时,效果更佳。
2.结论:
2.1相对于正常对照样品,PRMT5在PDAC样品中高表达,其通过增强NF-κB通路活性,导致下游促癌基因TNF-α和IL-8表达水平升高,增强PDAC细胞的增殖和侵袭能力,发挥促癌作用。
2.2miR-485-5p能够抑制PRMT5表达,从而改善疾病,发挥抑癌作用。
2.3坎地沙坦通过抑制PRMT5酶活性,从而改善疾病,发挥抑癌作用。
近几年研究发现,同乙酰化、磷酸化一样,蛋白质的甲基化也在癌症进展中发挥重要作用。精氨酸甲基转移酶5(Protein arginine methyltransferase enzyme5,PRMT5)是蛋白质精氨酸甲基转移酶家族(PRMTs)的重要成员,能够对称双甲基化多种组蛋白和非组蛋白。已知PRMT5在多种类型癌症中呈高表达,促进癌症进展,但在PDAC中的作用尚不清楚。本研究首先比较了人正常胰腺组织和胰腺癌组织样品、以及正常胰腺(Human pancreatic nestin expressing cells,HPNE)细胞和PDAC细胞(PANC-1,MiaPaCa2)中PRMT5的表达量。通过PCR扩增PRMT5片段,克隆获得慢病毒质粒,制备相应慢病毒,并分别感染PANC-1细胞,制备低表达和高表达PRMT5的PANC-1稳定细胞系和相应对照细胞系。在此基础上,研究PRMT5表达量对于PANC-1细胞的生物学影响,如NF-κB双荧光素酶实验检测NF-κB通路活性,qRT-PCR检测NF-κB下游相关基因(TNF-α和IL-8)的表达,CCK-8检测癌细胞的增殖能力,Transwell实验检测癌细胞的侵袭能力。
鉴于NF-κB通路在正常细胞中也发挥重要功能,所以直接抑制NF-κB活性不是最思想的PDAC治疗方法,如能够通过抑制PRMT5的表达或其酶活性,从而间接抑制NF-κB活性,则较为理想,为此,本研究进一步探求能够特异性抑制PRMT5的microRNAs(miRNAs)或药物。
miRNAs是一类保守、非编码的微小RNA,通过种子序列和靶基因互补配对,结合到相应的靶基因上,从而降解靶基因mRNA或抑制其翻译,在转录后水平调控基因表达。研究发现,许多miRNAs都参与PDAC疾病过程中。且另有报道在多种类型癌症中,miRNAs能够靶向抑制PRMTs的表达,从而改善疾病进展。但截至目前,在PDAC中,尚无文献报道两者是否存在相互作用。因此,本研究首先利用miRNA-seq实验,筛选受PRMT5表达量影响的miRNAs,结合使用预测软件TargetScan进一步分析、筛选出miR-485-5p作为研究对象。将miR-485-5p mimics及阴性对照NC分别转染至PANC-1细胞后,qRT-PCR检测miR-485-5p表达量,验证转染是否成功。再分别检测PRMT5的mRNA和蛋白表达量变化。并检测miR-485-5p对NF-κB活性和下游相关基因(TNF-α和IL-8)的表达量,以及对癌细胞增殖和侵袭的影响。并利用双荧光素酶报告系统检测PRMT53-UTR是否为miR-485-5p的靶基因,通过突变实验和回复实验进一步验证。
另外,除了利用miRNAs抑制PRMTs的表达,开发或筛选能够抑制PRMTs酶活性的抑制剂,也是一种有效的疾病治疗方法。本文通过纯化PRMT5蛋白,建立和鉴定均相光激化学发光免疫分析技术(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay,AlphaLISA)方法,并选用含美国FDA批准的药物文库,进行药物高通量筛选。由于一些药物本身具有颜色,为了去除假阳性结果,进行了淬火实验,最终筛选到坎地沙坦。采集其处理或未处理PANC-1细胞样品,Western Blot(WB)检测了其对PRMT5的酶活性影响。并测定了其在HPNE和PANC-1细胞中的IC50。以及对NF-κB活性和下游相关基因(TNF-α和IL-8)的表达量、癌细胞非贴附性生长和3D克隆形成、小鼠体内肿瘤生长的影响。本课题研究结果显示了PRMT5在PDAC中的促癌机制,并且筛选到抑制其表达或酶活性的miRNAs和药物,为PDAC的治疗提供了新的方案和参考。
1.主要研究结果:
1.1、PRMT5蛋白在PDAC样品中高表达。
免疫组化和WB结果显示:相对于正常人胰腺组织和HPNE细胞,PRMT5蛋白在PDAC组织和细胞系(PANC-1,MiaPaCa2)中表达量更高。
1.2、建立高或低表达PRMT5的PANC-1稳定细胞系后,发现PRMT5在PDAC中发挥促癌作用。
通过人为构建pLVX-PRMT5重组质粒,并制备和利用相应慢病毒(pLVX-PRMT5、pLVX-control,以及shscramble、shPRMT5)进行一系列实验。如NF-κB通路活性检测、qRT-PCR、CCK-8实验和Transwell实验结果显示,相比于对照组pLVX-control细胞,在pLVX-PRMT5细胞中,NF-κB通路活性升高,TNF-α和IL-8基因表达水平也显著升高,癌细胞增殖和侵袭能力显著增强;反之,在shPRMT5细胞中结果呈现相反趋势。
1.3、筛选到抑制PRMT5表达的miR-485-5p,其抑制PDAC进展。
通过miRNA-seq实验,并利用TargetScan预测软件,分析、筛选出miR-485-5p作为研究对象。将miR-485-5p mimics及阴性对照(NC)分别转染至PANC-1细胞后,相比于NC对照组,在过表达miR-485-5p的PANC-1细胞中,NF-κB活性、TNF-α和IL-8基因的表达量、癌细胞增殖和侵袭能力显著降低。
1.4、miR-485-5p靶向结合PRMT53-UTR,从而抑制PRMT5的表达。
qRT-PCR和WB结果显示,miR-485-5p能够抑制PRMT5的mRNA和蛋白表达水平。双荧光素酶活性实验和突变实验、回复实验结果显示,miR-485-5p通过种子序列靶向结合PRMT53-UTR,从而达到抑制作用。
1.5、筛选到抑制PRMT5酶活性的坎地沙坦,其抑制PDAC进展。
本研究通过纯化PRMT5蛋白,建立AlphaLISA方法。并检测方法的高通量性,淬火实验去除假阳性结果,最终筛选出药物:坎地沙坦(candesartan cilexetil)。
药物毒力检测结果显示,相比于在PANC-1细胞(IC50=18μM)中药效,坎地沙坦在HPNE细胞(IC50=70μM)中呈现低毒力,具有潜在应用价值。相比于未处理组,在经坎地沙坦处理的细胞中,PRMT5甲基化产物p65-R30me2蛋白表达水平显著下降,NF-κB活性发生药物浓度依赖性下降,TNF-α和IL-8基因表达水平下降。PANC-1细胞的非贴附性生长能力和3D克隆形成能力也呈现浓度依赖性下降;PDAC小鼠体内肿瘤生长实验结果显示,在未影响小鼠体重情况下,相比于对照组,不同剂量的坎地沙坦(10mg/kg、20mg/kg)均能抑制PDAC小鼠体内肿瘤的生长,当药物浓度为20mg/kg时,效果更佳。
2.结论:
2.1相对于正常对照样品,PRMT5在PDAC样品中高表达,其通过增强NF-κB通路活性,导致下游促癌基因TNF-α和IL-8表达水平升高,增强PDAC细胞的增殖和侵袭能力,发挥促癌作用。
2.2miR-485-5p能够抑制PRMT5表达,从而改善疾病,发挥抑癌作用。
2.3坎地沙坦通过抑制PRMT5酶活性,从而改善疾病,发挥抑癌作用。