鼻咽癌属于EB病毒引起的一种最常见的非淋巴细胞恶性肿瘤,全世界年发病率平均为1/10万,在东南亚,特别是我国南方的部分地区发病率达到100/10万。目前,临床上治疗鼻咽癌的手段虽然比较多,包括放射治疗、化疗和分子靶向治疗等,疗效也较好。由于鼻咽癌发生部位隐蔽、原发灶小、症状轻微,往往不为患者察觉和重视。鼻咽癌的生物学特性及周围淋巴组织丰富,使较其他头颈部肿瘤更具转移和浸润性,往往在出现临床症状前已远处转移,约90%的患者以颈部淋巴结肿大为首诊。局部的复发和远处转移是导致鼻咽癌治疗失败的原因。因此,探讨鼻咽癌浸润和转移机制具有重要意义。正常组织细胞在特殊情况下也具备迁移能力,如胚胎发育、免疫细胞、创伤愈合。而肿瘤细胞由正常细胞在多种因素作用下经过演变,形成强于正常组织细胞的转移和增殖能力。肿瘤细胞虽然具备自身特点,由于来源于正常组织细胞,在很多方面还是原有功能的沿用或是增强。我们试图通过寻找在正常细胞中证实已与细胞迁移增殖密切相关的因子,并对其机制进行研究。瞬时受体电位通道(TRP channels)是位于细胞膜上的一类重要的非选择性阳离子通道超家族。TRP通道分为：TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP、TRPN和TRPML 7大亚家族。TRP通道家族成员分布广泛,现已知,分布于中枢神经系统、外周神经系统、皮肤、心血管系统、呼吸系统、胃肠道系统、泌尿生殖系统以及免疫和内分泌系统等。TRPC的C末端,以TRP框为起点,存在一个保守的25个氨基酸序列区,叫TRP结构域,有关TRP结构域的功能目前还不清楚,Rohacs等研究提示,TRP结构域参与调节TRP通道的功能。TRPC(canonical TRP)亚家族包括TRPC1-7,共7种亚型。TRPC1在脑、心脏、肾脏、肺、骨骼肌、前列腺、皮肤、睾丸和卵巢都检测到其高水平表达。作为最早被发现的哺乳动物TRP通道,TRPC1公认的功能是参与受体介导的、钙依赖的平滑肌及腺体的分泌和收缩功能,参与细胞膜受体激活磷脂酶C(PLC)后所介导的钙离子进入。TRPC1通道为非选择性阳离子通道,主要通过的离子为钙离子、钠离子。TRP通道可以作为细胞膜Ca2+通道调节细胞内Ca2+浓度,参与体内与Ca2+信号相关的许多重要生理过程,如细胞的生长及细胞坏死、树突形成、细胞周期的调节、细胞的迁移等。大量研究表明,细胞内钙离子与肿瘤关系密切,直接参与调控肿瘤的生长、侵袭、转移和分化,从而导致肿瘤不可控制的扩散和侵犯。Yassine El Hiani等报道,在MCF-7细胞中,提高细胞内钙离子浓度可以引起TRPC1高表达和细胞增殖。Valerie C等证实TRPC1通道介导恶性神经胶质瘤的迁移。综合文献,我们认为瞬时受体电位通道家族之一的TRPC1可能与肿瘤细胞的迁移和增殖相关。本研究利用基因沉默技术和TRP通道特异阻断剂初步研究TRPC1基因在鼻咽癌增殖、侵袭中的作用,探讨TRPC1作为鼻咽癌癌分子靶点的可行性,为鼻咽癌癌患者的诊断、预后评价、综合治疗方案设计提供有力的理论依据。方法1、TRPC1蛋白在人鼻咽癌组织和正常鼻咽组织的分布和表达研究选取鼻咽癌病理切片30例,鼻咽部正常组织切片20例,用免疫组化(IHC)方法检测TRPC1蛋白在人鼻咽癌组织和正常鼻咽组织的分布和表达研究。2、TRPC1基因在人鼻咽癌细胞中的表达研究应用荧光定量PCR (QPCR)和免疫细胞化学方法检测CNE-2、C666-1和6-10B 3株鼻咽癌细胞中TRPC1基因的表达研究。根据目的基因TRPC1及看家基因β-actin的扩增曲线,得到各自的Ct值,通过公式计算2-ΔΔCt值,在相对定量分析中,我们以2-△ΔCt表示与CNE2相比,6-10B和C666-1细胞株中TRPC1基因的相对表达水平。采用单样本t检验比较6-10B、C666-1细胞株和CNE2中TRPC1 mRNA水平,独立样本t检验比较的6-10B和C666-1细胞株中TRPC1 mRNA水平。3、利用基因公司设计合成的3条针对TRPC1的siRNA片段及1条阴性对照siRNA片段,然后分别将这4条siRNA片段转染进入不同的CNE-2细胞,荧光定量PCR(QPCR)检测TRPC1基因干扰情况。挑选干扰效率最高的siRNA片段进行细胞稳转,建立稳定细胞株。4、采用病毒感染法分别将空质粒和干扰质粒pSuper-retro-puro转染进入不同的CNE-2细胞中,应用QPCR与Western Blot检测稳定细胞株的TRPC1基因及蛋白表达水平改变。5、QPCR检测基因沉默后TRPC1、MMP2和MMP9的变化根据目的基因TRPC1及看家基因β-actin的扩增曲线,得到各自的Ct值,通过公式计算2-ΔΔCt值,在相对定量分析中,以2-△ΔCt表示与未转染的CNE2相比,干扰(CNE2-siTRPC1)和空载(CNE2-vetor)转染后的CNE2细胞株中TRPC1、MMP2和MMP9基因的相对表达水平。采用单样本t检验比较CNE2-siTRPC1、CNE2-vetor与CNE2细胞的TRPC1、MMP2和MMP9 mRNA水平,独立样本t检验比较CNE2-siTRPC1和CNE2-vetor细胞中TRPC1、MMP2和MMP9mRNA水平。6、TRPC1基因表达沉默对鼻咽癌细胞生物学特性的影响(1)利用体外侵袭小室进行体外侵袭实验,检测TRPC1基因沉默后对鼻咽癌侵袭能力的影响；(2)利用MTT法及流式细胞术检测TRPC1基因沉默后对细胞体外增殖的影响。7、TRPC1阻断剂对鼻咽癌细胞生物学特性的影响使用TRP通道阻断剂2-APB作用于CNE2细胞后,应用QPCR与Western Blot检测TRPC1基因及蛋白表达水平改变,同时QPCR检测MMP2和MMP9的变化影响。利用MTT法及流式细胞术检测(?)TRPC1基因对细胞体外增殖和细胞周期的影响；利用体外侵袭小室进行体外迁移和侵袭实验,检测TRPC1基因对鼻咽癌迁移和侵袭能力的影响。结果1、TRPC1蛋白在人鼻咽癌组织和正常鼻咽组织的分布和表达研究免疫组化检测结果显示：鼻咽癌组织高表达,正常组织低表达.TRPC1蛋白在30例鼻咽癌组织中的总的阳性表达率为90%(27/30),高表达率为80%(24/30)。鼻咽癌组织TRPC1蛋白表达率(90%)显著高于鼻咽正常组织(5.0%)(X2=22.005,P=0.000<0.05)。鼻咽癌组织TRPC1蛋白表达强度显著高于正常组织(Z=-5.274,P=0.000<0.05)。2、TRPC1基因在人鼻咽癌细胞中的表达研究采用QPCR法检测三种鼻咽癌细胞株的TRPC1基因表达情况。结果表明：与CNE2(2-ΔΔCt=1)相比,6-10B (2-ΔΔCt= 0.552±0.037)和C666-1 (2-ΔΔCt=0.736±0.095)的TRPC1 mRNA水平均较低(t=-20.918,-4.757,P=0.002,0.041),说明CNE2细胞中的TRPC1 mRNA表达水平高。免疫细胞化学检测结果显示,TRPC1蛋白在鼻咽癌细胞株中胞浆中阳性表达。3、利用QPCR技术筛选出干扰效率最高的siRNA1 (80%)为下一步实验的研究对象(命名为CNE2-siTRPC1细胞)。4、采用磷酸钙转染法将干扰效率最高的pSuper-retro-puro-siTRPC1和’pSuper-retro-puro质粒分别与PIK包装质粒共转293FT包装细胞,经48小时后收集病毒上清感染鼻咽癌细胞CNE2,经嘌呤霉素(puro 0.5μg/ml) DMEM选择培养基中生长,筛选出沉默表达TRPC1基因细胞和对照细胞分别命名为CNE2-siTRPC1, CNE2-vetor5、荧光定量PCR和WB结果显示：CNE2-siTRPC1 (2-ΔΔCt= 0.149±0.031)与作为对照的细胞CNE2 (2-ΔΔCt=1)和CNE2-vetor (2-ΔΔCt=0.884±0.124)相比,TRPC1 mRNA水平有显著下调(t=48.125,P=0.000;t=-9.979, P<0.001)。Western blot结果分别从CNE2、CNE2-vetor和CNE2-siTRPC1中提取总蛋白经Western blot检测,结果表明CNE2-siTRPC1的TRPC1蛋白水平较CNE2-vetor和CNE2在蛋白水平显著降低(F=17057.026,P<0.001)。6、QPCR检测基因沉默后MMP2和MMP9的变化(1)采用QPCR法检测基因沉默后鼻咽癌CNE2细胞株的MMP2基因表达情况。结果表明：CNE2-siTRPC1 (2-ΔΔCt= 0.251±0.019)和作为对照的细胞CNE2 (2-ΔΔCt=1)与空载转染的CNE2-vetor (2-ΔΔCt= 0.953±0.054)细胞相比,MMP2 mRNA水平有显著下调(t=-66.090,P=0.000;t=-21.174, P<0.001)(2)采用QPCR法检测基因沉默后鼻咽癌CNE2细胞株的MMP9基因表达情况。结果表明：CNE2-siTRPC 1 (2-ΔΔCt= 0.264±0.011)和作为对照的细胞CNE2(2-ΔΔCt=1)与空载转染的细胞CNE2-vetor (2-ΔΔCt= 0.942±0.011)相比,MMP9 mRNA水平有显著下调(t=-115.678,P=0.000；t=-9.979,P<0.001)7、TRPC1基因表达沉默对鼻咽癌细胞生物学特性的影响(1)体外侵袭小室实验检测TRPC1基因表达沉默后细胞侵袭能力的改变,结果显示,各组整体比较有显著性差异(F=9.289,P=0.015)。其中,与CNE2和CNE2-vetor细胞相比,CNE-2-siTRPC1细胞的迁移能力显著降低(P=0.007,P=0.017),说明TRPC1基因的沉默抑制了鼻咽癌细胞的侵袭能力。(2)MTT法观察TRPC1基因表达沉默后体外细胞的增殖情况,与CNE-2细胞相比,CNE-2-siTRPC1细胞的增殖速度明显减慢,并且呈时间依赖关系(F=574.752,P=0.000)。利用流式细胞术检测两组细胞的细胞周期结果显示CNE-2-siTRPC1细胞周期中S期的比例明显减少(F=9.648,P=0.013),表明TRPC1基因表达沉默后细胞增殖缓慢。结果提示TRPC1基因表达水平减低后,肿瘤细胞体外生长被显著抑制。8、TRP阻断剂对鼻咽癌细胞生物学特性的影响(1).QPCR法和Western blot技术检测TRPC1通道阻断后体外细胞的TRPC1表达情况。荧光定量PCR结果：CNE2-2-APB细胞、CNE2-siTRPC1细胞、CNE2及CNE2-vetor细胞的TRPC1mRNA整体比较有显著差异(F=31.799,P=0.001), CNE2-2-APB (2-ΔΔCt= 0.640±0.037)和CNE2-siTRPC1 (2-ΔΔCt= 0.644±0.061)与CNE2(2-ΔΔCt=1)相比,TRPC1 mRNA水平有显著下调(t=-17.065,P=0.003；t=-10.068,P=0.010)。Western blot结果：分别从CNE2、CNE2-vetor、CNE2-2-APB和CNE2-siTRPC1中提取总蛋白经Western blot检测,结果表明CNE2-2-APB细胞、CNE2-siTRPC1细胞、CNE2及CNE2-vetor细胞的TRPC1蛋白水平整体比较有显著差异(F=92.022, P=0.000), CNE2-2-APB细胞和CNE2-siTRPC1的TRPC1蛋白水平较CNE2-vetor和CNE2在蛋白水平显著降低(P=0.002；P=0.002)。说明TRP阻断剂显著降低了CNE2细胞中的TRPC1的表达。(2).QPCR法检测TRPC1阻断后体外细胞的MMP2和MMP9情况。荧光定量PCR结果：CNE2-2-APB细胞、CNE2-siTRPC1细胞、CNE2及CNE2-vetor (2-ΔΔCt= 1.043±0.073)细胞的MMP2mRNA整体比较有显著差异(F= 148.035, P=0.001), CNE2-2-APB (0.310±0.389)和CNE2-siTRPC1细胞(2-AACt=0.235±0.010)与作为对照的细胞CNE2 (2-ΔΔCt=1)相比,MMP2 mRNA水平有显著下调(t=-30.478,P=0.000;t=-129.978,P=0.000)。同样,MMP9的荧光定量PCR结果显示：CNE2-2-APB细胞、CNE2-siTRPC1细胞、CNE2及CNE2-vetor细胞的MMP9mRNA整体比较有显著差异(F=386.614, P=0.000), CNE2-2-APB和CNE2-siTRPC1细胞(2-ΔΔCt=0.149±0.031)与作为对照的细胞CNE2(2-ΔΔCt=1)相比,MMP9 mRNA水平有显著下调(t=-55.693, P=0.000; t=-93.595,P=0.000)。(3).MTT法观察TRPC1通道阻断后体外细胞的增殖情况,CNE2组、CNE2-vetor组、CNE2-siTRPC1组和(?)CNE2-2-APB组之间的增殖速度具有显著差异(F=406.681,P=0.000),与CNE-2细胞和CNE2-vetor相比,CNE-2-2-APB细胞的增殖速度明显减慢,并且呈时间依赖关系(F=393.584,P=0.000)。利用流式细胞术检测四组细胞的细胞周期结果显示2-APB-CNE-2细胞周期中S期的比例明显减少,差异显著(F=14.010,P=0.002<0.05),G1期比例增高显著(F=25.960,P=0.000),表明TRPC1通道阻断后细胞周期阻滞在G1期。结果提示TRPC1通道阻断后,肿瘤细胞体外生长被显著抑制。(4).体外侵袭小室实验检钡(?)TRPC1通道阻断剂后细胞迁移能力的改变,结果显示,CNE2组、CNE2-vetor组、CNE2-siTRPC1组和CNE2-2-APB组之间的迁移能力具有显著差异(F=686.820.989,P=0.000),与CNE-2-mock细胞和CNE2-siTRPC1相比,CNE-2-2-APB细胞的迁移能力明显降低(P=0.000,P=0.000),说明TRPC1通道阻断抑制了鼻咽癌细胞的迁移能力。(5).体外侵袭小室实验检测(?)TRPC1通道阻断剂后细胞侵袭能力的改变,结果显示,CNE2组、CNE2-vetor组、CNE2-siTRPC1组和CNE2-2-APB组之间的侵袭能力具有显著差异(F=434.989,P=0.000),与CNE-2-mock细胞和CNE2-siTRPC1相比,CNE-2-2-APB细胞的侵袭能力明显降低(P=0.000,P=0.001),说明TRPC1通道阻断抑制了鼻咽癌细胞的侵袭能力结论：1. TRPC1蛋白在肿瘤组织中高表达,表明TRPC1可能是导致肿瘤发生发展的重要分子；2、重组质粒pSuper-retro-puro-siTRPC1转染CNE2细胞株后用puro出了稳定沉默TRPC1基因的CNE2-siTRPC1细胞株,为研究TRPC1基因的功能提供了有价值的研究工具；3、TRPC1基因沉默和TRP通道阻断后可抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭,表明TRPC1基因可促进鼻咽癌细胞的增殖和侵袭,提示TRPC1基因在鼻咽癌细胞的增殖和侵袭中起重要作用。本研究的创新之处1.发现TRPC1与鼻咽癌的增殖、侵袭及预后相关,为开展鼻咽癌基因靶向治疗奠定了理论基础；2.建立了TRPC1基因沉默的鼻咽癌细胞株,为研究TRPC1基因在鼻咽癌发生发展中的作用提供了有价值的研究工具。