半胱氨酸残基是蛋白质体系中最重要的亲核性基团,其活性与蛋白质的生物化学功能紧密联系。许多临床药物如奥希替尼、依鲁替尼等通过共价修饰靶标蛋白的活性半胱氨酸而产生相关药理、药效性质。因此,开发半胱氨酸修饰基团对药物发现具有十分重要的意义。目前针对半胱氨酸的亲电基团主要仍以α,β-不饱和双键为主。然而通过α,β-不饱和双键单一结构找到的靶标与半胱氨酸位点相对有限,生物体内还有大量的活性半胱氨酸位点有待发掘鉴定。因此我们希望发展新型半胱氨酸选择性探针,同时结合活性导向蛋白谱学分析技术(ABPP),期望发现新的可修饰半胱氨酸位点与靶标蛋白,为药物发现提供基础。四氮唑基团具有较好的疏水性和吸电子性,同时也是部分临床药物的重要结构片段,课题组前期围绕四氮唑开展了系列研究工作。本论文中,我们基于四氮唑活性构建了系列活性导向分子探针(Tz1-8),期望通过四氮唑活性亚结构片段使得分子探针能够修饰前期未被发现的活性半胱氨酸位点。所得到的分子探针表现出了良好的生物活性与标记效率,系列半胱氨酸位点被鉴定。主要工作包括:1.设计、合成一系列卤甲基四氮唑探针,并在纯蛋白水平和细胞水平比较探针的标记效率,确定Tz-1为标记效率最高的探针并用于后续研究。2.在纯蛋白、细胞裂解液和活细胞水平进行了蛋白标记,验证了探针在多大浓度,多长的孵育时间下能显示出明显标记,证明了分子探针的良好的标记效率。同时,通过加入IAA等竞争性抑制剂初步验证了探针的选择性。3.我们通过生物质谱实,确认了碘甲基四氮唑在各种水平上对半胱氨酸的选择性均超过90%,并且发现它能够标记许多细胞代谢增殖过程中的重要蛋白的活性中心或活性中心附近区域的半胱氨酸,如谷胱甘肽S-转移酶的32位半胱氨酸、硫醇特异性过氧化物酶的47位半胱氨酸、神经生长因子受体磷酸化位点附近的310号半胱氨酸,对后续研究具有重要意义。综上所述,碘甲基四氮唑是我们成功开发的一种对半胱氨酸残基具有高反应性和高选择性的基团,后续我们希望可以通过对其进行更深入的研究对半胱氨酸残基活性做出定量描述,以找出更多蛋白质活性位点,为疾病治疗和化学蛋白质组学研究提供有价值的工具分子。