论文部分内容阅读
鸡球虫病作为一种危害严重的肠道寄生虫病,通常由多种艾美耳球虫引起,其中柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）致病力最强,危害最为严重,每年给全世界的养禽业造成巨大的经济损失。E.tenella是一种专性细胞内顶复门原虫,寄生于盲肠上皮细胞,对宿主细胞感染与增殖的关键是粘附与入侵,这一过程需要多种蛋白参与,其中膜蛋白、MICs蛋白、ROPs蛋白、一些表面抗原以及致密颗粒蛋白等已被证明是入侵相关蛋白。最近研究表明,硫氧还蛋白（Trx）也参与了寄生虫入侵宿主细胞的过程,但此作用在球虫领域还未见有人报道。目前对球虫病的防控主要依赖于抗球虫药物以及活疫苗或灭活苗,但由于耐药性寄生虫的出现和活疫苗使用的难度,迫切需要新型疫苗来控制鸡球虫病。所以通过研究球虫的入侵相关蛋白来加深对球虫入侵致病机理和球虫-宿主之间互作机制的了解,并制备更有效的抗球虫药物或疫苗,已成为研究热点。本研究鉴定了鸡柔嫩艾美耳球虫硫氧还蛋白（EtTrx1）和子孢子抗原蛋白（EtU6L6D9）,并对其亚细胞定位、表达水平及基本功能进行了初步研究。具体内容如下:1.EtTrx1和EtU6L6D9基因序列分析及其鉴定本研究以Gen Bank公布的基因序列（XM＿013375329.1）为参考设计引物,以E.tenella（SD-01株）c DNA为模板,成功扩增EtTrx1基因并进行生物信息学分析。结果表明该基因c DNA序列全长为312 bp,共编码103个aa,蛋白大小约为12 k Da,无信号肽且无跨膜区,推测理论等电点为5.4,是一种偏酸性的蛋白质。该蛋白符合Trx家族的结构特征,在10～100 aa处有一个Trx domain,包含一个典型的Trx flod和一个活性位点WCGPC motif（29～33 aa）。与其他物种中已确定的Trx进行对比,具有较高同源性且具有相同的结构域。序列比较分析表明该蛋白与其他Eimeria属的Trx相比同源性较高,且Trx domain保守性高。同样,参考Gen Bank公布的（XM＿013379449.1）基因序列设计引物,以E.tenella（SD-01株）c DNA为模板,得到的结果显示EtU6L6D9基因全长为651 bp,共编码216个aa,计算的蛋白大小约为22 k Da,是一种中性蛋白。在1～18 aa处有一个信号肽,但无跨膜区。通过结构预测分析该蛋白无典型的结构域,需进一步深入研究。2.EtTrx1和EtU6L6D9的亚细胞定位分析为观察EtTrx1蛋白和EtU6L6D9蛋白在E.tenella的定位及蛋白分泌情况,本试验采用常规方法表达原核蛋白并成功制备多克隆抗体,经抗体效价和特异性鉴定后用于后续试验。IFA结果表明,在不透化条件下EtTrx1蛋白均匀分布在E.tenella子孢子的细胞膜上,透化时位于子孢子的细胞质和细胞核中,其中在细胞核中表达量更高;EtU6L6D9蛋白在不透化条件下也均匀的分布在E.tenella子孢子的细胞膜上,透化时除了在细胞质中有分布,在某一细胞器膜上也有均匀分布。并且蛋白分泌鉴定结果显示EtTrx1蛋白和EtU6L6D9蛋白均为分泌蛋白。3.EtTrx1和EtU6L6D9在E.tenella不同发育阶段差异表达分析通过q PCR和western-blot试验分析EtTrx1和EtU6L6D9在E.tenella不同阶段的转录及蛋白表达水平差异,结果表明,相比较于UO和SO,EtTrx1在MZ和SZ中的转录水平和蛋白表达水平更高,且两个阶段之间无明显差异;而EtU6L6D9在SO和MZ的表达水平更高。已知裂殖子和子孢子阶段是球虫入侵的两个关键阶段,只有侵入到宿主细胞才能继续生命活动,EtTrx1蛋白和EtU6L6D9蛋白在这两个阶段的高效表达揭示了这两个基因很有可能参与了球虫入侵。4.EtTrx1和EtU6L6D9在粘附及入侵宿主细胞中的功能分析为进一步验证EtTrx1蛋白和EtU6L6D9蛋白是否与粘附和入侵宿主相关,进行了如下试验,其中粘附分析结果表明,表面表达EtTrx1蛋白的酵母细胞对宿主细胞的粘附率是阴性对照的3.1倍,表面表达EtU6L6D9蛋白的酵母细胞对宿主细胞的粘附率是阴性对照的4倍;入侵阻断试验结果表明,经抗EtTrx1多抗和抗EtU6L6D9多抗分别预处理后,子孢子入侵DF-1细胞的能力明显下降,EtTrx1蛋白的入侵抑制率为36.75%,EtU6L6D9蛋白的入侵抑制率最高可达42%。上述结果说明EtTrx1和EtU6L6D9可能参与E.tenella的粘附与入侵过程。5.重组蛋白亚单位疫苗的免疫保护效果评价为探讨重组EtTrx1蛋白亚单位疫苗和重组EtU6L6D9蛋白亚单位疫苗对鸡的免疫保护作用,本研究通过平均体重增加、盲肠病变情况、病理组织变化、卵囊排出量、ACI指数、抗体水平变化及淋巴细胞分化情况等指标对其保护效果进行了评价。结果发现这两个蛋白均能提供良好的保护效果,EtTrx1的抗球虫指数（ACI）为163.70,EtU6L6D9的抗球虫指数（ACI）为161.50。血清Ig G和黏膜Ig A抗体水平显著升高表明蛋白免疫后不仅可以诱导机体产生高滴度的血清抗体,还可以刺激机体粘膜免疫系统抵抗球虫感染。EtTrx1蛋白和EtU6L6D9蛋白均可作为新型疫苗开发的候选者。6.EtTrx1可能互作蛋白的鉴定与分析通过查阅文献筛选出了一些与EtTrx1可能互作的蛋白,试图通过了解蛋白间相互作用的机制,探究该蛋白在入侵宿主过程中发挥的作用。先后通过酵母双杂交技术和GST Pull-down技术分别进行验证。酵母双杂结果显示EtTrx1蛋白与Gg GPX3、Gg DIO3、Gg SELENON、Gg TXNIP存在互作关系。GST Pull-down结果表现为EtTrx1蛋白与Gg TXNIP存在相互作用,与Gg GPX3、Gg DIO3、Gg SELENON则不存在相互作用。所以综合以上,得出EtTrx1蛋白与Gg TXNIP为互作蛋白,为后续EtTrx1的功能及其互作机制的研究提供了参考。