论文部分内容阅读
背景与目的：细胞死亡是多细胞生物生命过程中重要的生理或病理现象。多细胞生物的发育及生存依赖于其细胞增殖、分化和死亡之间的平衡，一旦这种平衡被打破，就会发生胚胎发育异常、退行性疾病以及癌症等。细胞死亡有主动性的程序性细胞死亡(Programmed cell death，PCD)和被动性的非程序性细胞死亡之分，后者即坏死。程序性细胞死亡除去经典凋亡，最近几年更发现了几种不同的死亡表型，可通称为非凋亡程序性细胞死亡(Non-apoptotic Programmed Cell Death)。迄今为止，尽管对非凋亡PCD进行了大量研究，但这一类型细胞死亡的生理、生化基础尚不清楚。MAPKs丝裂原活化蛋白激酶家族是生物体内重要的信号转导系统，MAPK信号转导通路是多种膜受体传导的生长信号跨膜传递的交汇点或最后共同通路，参与细胞基质、生长因子、炎症反应等重要的信号途径，介导生长、发育、分裂、分化、凋亡以及细胞间相互作用等多种细胞过程。本课题希望通过神经元非凋亡PCD体外模型的建立，揭示非凋亡PCD在细胞形态学方面的一些特点，着重探讨其与MAPK信号通路的关系。方法与材料：(1)样本来源于大鼠大脑皮层神经元原代培养，海藻人酸(Kainic Acid，KA)各剂量组(5，10，50，100，500μmol／1，6小时)通过谷氨酸受体KA／AMPA诱导神经细胞非凋亡性PCD体外模型，光镜观察，TUNEL法和DNA凝胶电泳检测非凋亡性PCD，扫描电镜观察细胞表面形态；(2)应用免疫组化和蛋白印迹法(Western blotting)共同检测磷酸化MAPK／JNK的表达，了解P38的活化；(3)MAPK／JNK的特异性抑制剂SP600125和P38的特异性抑制剂SB203580抑制活化JNK1／2和P38的表达，用MTT法检测抑制前后细胞生存率差异，光镜观察抑制前后细胞的形态学变化，并进行空、泡细胞计数：(4)所用数据均用SPSS10．0软件分析，多组间比较用方差分析，两组间比较用T检验，检验水准α=0．05。结果：神经元胞浆广泛空泡化，TUNEL检测空泡细胞呈阴性，DNA凝胶电泳未见典型凋亡细胞DNA片段，空泡细胞胞膜完整，略显粗糙。Westernblotting检测见KA组磷酸化JNK1／2较正常对照组增高；磷酸化JNK1／JNK2表达有随KA剂量加大而增加的趋势，但差异无统计学意义；SP600125能有效抑制磷酸化JNK1／2的表达。KA组磷酸化P38与正常对照比无明显变化，与KA无剂量依赖关系，SB203580能有效抑制磷酸化P38的表达。免疫组化染色检测胞核磷酸化JNK1／JNK2阳性，磷酸化P38弱阳性。KA组细胞存活率较正常对照组降低，随KA剂量增大而降低；SP600125抑制剂组细胞存活率较KA组升高；SB203580抑制剂组细胞存活率与KA组相比无明显变化。KA组空泡细胞较正常对照组增多；SP600125抑制剂组较KA组空泡细胞减少；SB203580抑制剂组较KA组空泡细胞无明显变化。结论：KA可诱导神经元非凋亡PCD体外模型，扫描电镜可观察到其细胞胞膜完整。MAPK／JNK信号通路可能介导KA经KA／AMPA受体诱导的神经元非凋亡PCD，这种非凋亡PCD是能被SP600125所抑制的，细胞中活化JNK的表达与KA作用时间和剂量之间的相关性尚不明确；未发现MAPK／p38途径直接参与介导KA诱导的神经元非凋亡PCD，SB203580对KA诱导神经元非凋亡PCD无明显抑制作用。