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脐血作为造血干细胞的又一来源,具有细胞增殖潜力高、没有来源限制、HLA配型要求低等优点,在各类血液病和先天性遗传疾病的治疗、肿瘤患者化放疗后造血和免疫功能重建、免疫治疗、基因治疗等方面都有着广泛的应用前景.但单份脐血体积较小,所含造血干细胞数量有限,限制了其临床应用,因此迫切需要解决造血细胞体外扩增技术这一瓶颈问题.为此,该文重点对脐血单个核细胞分离和冷冻复苏技术、体外悬浮培养和扩增技术以及搅拌式生物反应器系统等方面进行了实验研究,并通过动物实验对体外扩增细胞在小鼠体内的造血重建能力进行了考察,旨在进一步优化脐血细胞库建设中的造血干/祖细胞分离和冷冻复苏技术,建立临床规模的造血干/祖细胞体外扩增技术及其生物反应器系统,从而为未来实现造血干/祖细胞的临床应用奠定基础.首先对脐血单个核细胞的分离条件进行了优化,研究中发现在HES重力沉降分离脐血过程中存在单个核细胞向上、红细胞团向下的对流现象,提高悬浮液中细胞浓度和增加沉降距离可以加强这种对流的发生、促进单个核细胞向上层的集中,从而提高该过程中单个核细胞的收率.脐血造血细胞在转瓶中悬浮培养时总细胞、CD34<+>细胞和各系集落形成细胞的扩增倍数均高于方瓶,这主要得益于悬浮培养的三维培养环境.对各系祖细胞和成熟细胞占总细胞比例随时间变化的分析表明,与静态培养环境相比,温和的搅拌环境不会影响造血干/祖细胞的分化速度和方向.实验测定脐血单个核细胞的沉降速率为5.3 mm/hr~11.8 mm/hr,据此并结合反应器体积确定了上流式沉降器的尺寸和操作条件,利用此沉降截留系统实现了造血细胞在搅拌式反应器中的灌注培养.经12天的扩增,由267×10<6>单个核细胞扩增得到1,082×10<6>个总细胞、6.3×10<6>个CFU-GM、6.2×10<6>个CFU-Mix和23×10<6>个CD34<+>细胞;另一次实验由180×10<6>单个核细胞扩增得到1,080×10<6>个总细胞、4.65×10<6>个CFU-GM、11.O×l0<6>个CFU-Mix和25.0×10<6>个CD34<+>细胞,基本满足了成人造血干细胞移植所需的细胞量.而且培养12天时反应器中干/祖细胞的含量显著高于方瓶回流换液培养,说明灌注培养能更好地维持造血干/祖细胞的扩增.对反应器灌注培养所得细胞和其它条件培养所得细胞进行了SCID小鼠体内造血重建实验,结果表明灌注培养所得细胞能在SCID小鼠体内实现造血重建,而且嵌合生长良好.以纯化的CD34<+>细胞为起始细胞,添加FL、TPO和SCF能有效促进干细胞扩增,而且扩增后细胞的造血重建能力最强.