酪蛋白(casein)是牛乳中主要的蛋白之一,其消化后能产生许多具有生理功能的活性肽,如阿片样肽、血管紧张素转化酶抑制肽、免疫调节肽、抗菌肽、抗血栓肽、矿物元素结合肽等,除此之外,近几年还发现抗炎肽,这些成分的发挥无疑是有益于人们的健康。但是酪蛋白是导致婴幼儿牛乳过敏主要的过敏原之一,其主要的临床表现为皮肤症状,如荨麻疹、血管神经性水肿、湿疹;其次是胃肠道表现。除此之外,酪蛋白是几种含磷蛋白的复合体,以胶束状态存在于乳中,呈现为粗糙的球形粒子,很大程度上导致了牛乳蛋白在婴儿胃内的难消化性。因此,降低酪蛋白的过敏反应和促进其水解具有重要意义。超高压技术作为一种新型的非热杀菌技术,可以破坏蛋白的二级、三级和四级结构,改变蛋白构象,提高蛋白质的可消化性和降低其过敏反应。本课题旨在利用超高压处理技术,采用不同的压力、温度、时间和超高压次数来处理乳源酪蛋白,并体外模拟消化,探讨酪蛋白在不同条件下的消化及其过敏性反应的情况,并且采用正交设计分别得到降低酪蛋白过敏和促进水解的最佳高压次数、压力、时间、温度。采用Caco-2单层细胞模型,对经过超高压处理后的酪蛋白肽进行生物利用度评价。目的:1.采用正交设计对乳源酪蛋白进行超高压处理,分析降低乳源酪蛋白抗原性的最佳处理条件。2.采用正交设计对乳源酪蛋白进行超高压处理,分析促进乳源酪蛋白水解度的最佳处理条件。3.对超高压处理结合模拟成人和婴儿胃肠消化条件获得酪蛋白肽进行生物利用度评价。研究方法:1.制备酪蛋白溶液,以压力、温度、保压时间、高压循环次数四个处理因素进行超高压试验,并对处理后的酪蛋白体外模拟成人、婴儿胃肠消化条件进行消化,以酪蛋白抗原消减结果为指标进行单因素试验和正交设计来对超高压处理后酪蛋白消化水平条件进行优化,来获得最佳的压力、温度、保压时间、高压循环次数组合,采用间接竞争酶联免疫法测定乳源酪蛋白抗原性。2.制备酪蛋白溶液,以压力、温度、保压时间、高压循环次数四个处理因素进行超高压试验,并对处理后的酪蛋白体外模拟成人、婴儿胃肠消化条件进行消化,以水解度为指标进行单因素试验和正交设计来对超高压处理后酪蛋白消化水平条件进行优化,来获得最佳的压力、温度、保压时间、高压循环次数组合,采用三硝基苯磺酸法测定乳源酪蛋白的水解度。3.MTT法检测6种不同处理条件下产生的酪蛋白肽对Caco-2细胞毒性的影响。4.建立Caco-2单层细胞模型。测定Caco-2细胞跨膜电阻值、荧光素钠标志物的吸收转运以及碱性磷酸酶活性的表达,采用上述方法对所建立的Caco-2单层细胞模型进行综合评价,并将Caco-2单层细胞模型用于酪蛋白肽生物利用度评价。5.乳源酪蛋白经过超高压处理及其模拟胃肠消化后,测定酪蛋白肽在Caco-2单层细胞模型中肽氮的吸收率,评价处理后乳源酪蛋白的生物利用度。研究结果:1.超高压处理乳源酪蛋白之后,分别模拟成人、婴儿胃肠消化条件对乳源酪蛋白超高压处理样本进行消化。结果表明,超高压对乳源酪蛋白抗原性均有消减作用,超高压结合模拟成人胃肠消化条件的最佳参数是:压力350 MPa、温度30 ℃、保压时间15 min、高压3次,抗原抑制率为22.67%;超高压结合模拟婴儿胃肠消化条件的最佳参数是:压力350 MPa、温度30 ℃、保压时间20 min、高压1次,抗原抑制率为 39.95%。2.超高压处理乳源酪蛋白之后,分别模拟成人、婴儿胃肠消化条件对乳源酪蛋白超高压处理样本进行消化。结果表明,超高压对乳源酪蛋白水解度均有促进作用,超高压结合模拟成人胃肠消化条件的最佳参数是:压力350MPa、温度35℃、保压时间30min、高压2次,水解度为12.68%;超高压结合模拟婴儿胃肠消化条件的最佳参数是:压力300MPa、温度30℃、保压时间35min、高压2次,水解度为11.52%。3.MTT结果表明,在实验所用的剂量范围内,不同处理条件下的酪蛋白肽作用于Caco-2细胞24h,酪蛋白肽对Caco-2细胞无细胞毒性作用。4.Transwell细胞培养板中每孔Caco-2细胞的电阻值均大于500Ω· cm2,第19天和21天时,其荧光素钠的表观渗透系数(Papp)均分布在0.1～0.7×10-6cm/s范围内,碱性磷酸酶AP侧/BL侧为5.32,说明Caco-2细胞在Transwell细胞培养板中形成完整致密的单层细胞膜。5.在模拟成人胃肠消化条件下,对照组酪蛋白肽转运吸收率为7.26%,水解度最优组的酪蛋白肽转运吸收率最高,为9.44%,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。消减抗原最优组的酪蛋白肽转运吸收率为7.88%,与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。在模拟婴儿胃肠消化条件下,对照组酪蛋白肽转运吸收率为5.76%,水解度最优组和抗原消减最优组的酪蛋白肽转运吸收率明显高于对照组(P<0.05),且水解度最优组的酪蛋白肽转运吸收率最高,为6.94%。研究结论:本研究通过正交设计获得消减乳源酪蛋白抗原性和增加乳源酪蛋白水解度最优超高压处理参数,模拟成人和婴儿胃肠消化条件对超高压处理乳源酪蛋白进行消化,获得乳源酪蛋白肽。成功建立了 Caco-2单层细胞模型,并使用该模型评价酪蛋白肽的生物利用度,经过超高压处理结合模拟成人和婴儿胃肠消化条件获得的酪蛋白肽生物利用度高于对照组。