背景与目的放射治疗是肿瘤治疗中的一项重要手段,随着肿瘤发病率的增高,放射治疗的应用相对以往明显增加,随之出现的放射性损伤也相应增多。自1895年伦琴发现X射线,以及铀、镭等相继发现,揭开了人类利用电离辐射的序幕。然而,电离辐射却是一把双刃剑,它也会对人体健康造成一定的危害。辐射损伤是由于辐射能作用于机体后引起体内一系列的变化,当损伤严重时可使组织器官发生不可逆的破坏甚至导致机体死亡。国内外学者对于辐射损伤的氧自由基学说较为肯定,氧自由基的产生和清除保持一个动态的平衡,辐射损伤可生成大量自由基,引发脂质发生氧化反应,导致细胞膜破坏和细胞死亡,继而引起体内抗氧化物质活力的变化,打破机体的氧化-抗氧化体系的平衡。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是体内重要的自由基清除剂,在机体的氧化与抗氧化平衡中发挥重要的作用,能清除自由基,保护细胞膜免受氧化和脂质过氧化损伤。丙二醛(malondialdehyde, MDA)是自由基攻击生物膜引发脂质过氧化的产物,可与蛋白、核酸(DNA、RNA)和磷脂等含有氨基的物质交联,引起这些大分子化合物的分子交联。因此MDA水平可反映机体内脂质过氧化的程度,其在血液的水平可间接反映细胞损伤的程度。本实验研究观察指标之一就是间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)移植后能否改变大鼠体内氧自由基水平。肾脏、睾丸、肺脏、肝脏等机体脏器属于放射高敏感性器官,容易受到辐射损伤,出现器官功能障碍,影响机体代谢、解毒、分解等,最终导致生命危害。本研究模拟临床放射治疗的辐射模式建造损伤模型,并检测相应脏器的功能指标,探索辐射损伤后各脏器结构、功能的变化以及MSCs干预治疗的效果。MSCs是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞,国内外研究发现MSCs能够在特定条件下分化为骨细胞、软骨细胞、神经细胞等；是组织工程、细胞及基因治疗理想的靶细胞。它不仅取材方便、培养容易、增殖较快,而且具有多向分化潜能,免疫原性也较低的特点,低表达MHCⅠ和不表达MHCⅡ提示在进行同种异体间输注时,不会产生排斥反应。目前对于辐射损伤的治疗仅仅停留在调节、改善的水平上,未能从根本上解决问题。本实验立题基于MSCs这些特性进行干预治疗,采用同种异基因MSCs进行输注,研究MSCs在辐射损伤大鼠体内修复和改善受损脏器结构和功能。实验方法第一部分大鼠间充质干细胞的体外培养与鉴定实验在无菌条件下分离大鼠肱骨、股骨和胫骨,用PBS缓冲液冲出骨髓,离心后接种含10%胎牛血清(FBS)的L-DMEM培养基中,按2×106／cm2密度接种于培养瓶中,置于孵箱中培养。48h后半量换液,第五天全量换液,待细胞生长至80-90%融合时,0.25%胰酶消化传代。倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞术进行细胞周期分析,用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD29及CD44的表达,进行细胞鉴定,从而为本实验提供大量的同种异基因大鼠骨髓间充质干细胞。第二部分MSCs治疗辐射损伤效果的研究选取15只雄性SD大鼠随机分为三组,即对照组、模型组和治疗组。模型组和治疗组大鼠一次性接受直线加速器产生的X线照射,6Gy／周,共3周,总剂量18Gy,对照组不接受照射。其中治疗组大鼠在接受照射24h后尾静脉注射间充质干细胞3×106／只,共三次；模型组和对照组大鼠同期尾静脉注射同等体积的生理盐水。常规饲养大鼠,待模型组大鼠处于濒死状态时,腹腔注射苯巴比妥钠注射液麻醉大鼠,提取大鼠血清应用全自动分析仪及酶标仪检测血清中肌酐(Creatinine, Cr)、尿素(Urea,UA)、丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬门氨酸氨基转移酶(Aspartate Aminotransferase,AST)、乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)及睾酮(Testosterone, T)的水平；采用硫代巴比妥酸和黄嘌呤氧化法分别检测血清和各个组织中MDA含量和SOD活性；制作各个组织常规石蜡切片,观察三组大鼠各个组织结构的差异,从功能学水平,生化水平及细胞形态学水平研究MSCs是否具有治疗辐射损伤的作用。统计学方法实验资料结果用均数士标准差(x±s)表示,显著性标准为P<0.05,采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析。组间比较用单因素方差分析(One-Way ANOVA);重复测量数据用重复测量方差分析(Reperted measurement experiment);组间两两显著性比较方差齐采用LSD法,方差不齐用Dunnett T3。相关性采用偏相关分析(Partial correlation analysis)。结果第一部分大鼠间充质干细胞的培养与鉴定①本实验分离的骨髓间充质干细胞于48h后贴壁生长,全量换液后可见细胞呈星形、多边形和不规则形；10天左右时,细胞即可融合近80%。传代培养后细胞形态基本上趋于一致,光镜下见细胞呈梭形,核圆,位于细胞中央,胞质肥大,胞膜清晰；②流式细胞术证明G0+G1期的细胞约占80%以上,说明MSCs在体外具有只增殖不分化的特点；③经流式细胞仪检测,Cell Quest软件分析,结果显示第3代MSCs的特异性表面标志物：CD34-/CD45-/CD29+/CD44+,CD29+、阳性率为98.9%,CD44+、阳性率为93.5%,说明本实验培养的细胞为间充质干细胞。第二部分MSCs移植治疗辐射损伤效果的研究①观察大鼠的一般状态：对照组大鼠精神状态好,活动自如；模型组大鼠精神萎靡,反应迟钝,活动少,嗜睡,毛发变黄；治疗组大鼠精神状态一般,毛发微黄,反应较模型组灵敏。②全自动生化分析仪检测血清中肌酐和尿素的含量,结果显示：对照组、模型组及治疗组血清中尿素含量分别为4.90±0.31、19.64±0.75、11.88±1.16mmol/ml;Levene检验方差不齐,F=5.956,P=0.016；采用Dunnett’s T3法进行多重比较,P值均<0.05,差异具有统计学意义。肌酐含量分别为44.20±3.56、85.40±4.62、58.40±3.51μmol/ml,Levene检验方差齐,F=0.276,P=0.763；采用LSD法进行组间两两比较,P值均<0.05,差异具有统计学意义。③全自动生化分析仪检测血清中ALT、AST、ALP及LDH的含量,结果显示：对照组、模型组及治疗组血清中ALT的含量分别为19.00±6.32、54.20±3.56、36.00±4.74IU/L;Levene检验方差齐,F=0.757,P=0.490；采用LSD法进行组间两两比较,P值均<0.05,差异具有统计学意义。AST的含量分别为48.00110.93、187.80137.09、89.80±13.37IU/L;Levene检验方差齐,F=2.486,P=0.125；采用LSD法进行组间两两比较,P值均<0.05,差异具有统计学意义。ALP的含量分别为5.40±3.44、342.60153.87、163.40123.87 IU/L;Levene检验方差不齐,F=7.135,P=0.009；采用Dunnett’s T3法进行多重比较,P值均<0.05,差异具有统计学意义。LDH的含量分别为133.40±34.27、768.20±27.99、407.60±63.82 IU/L;Levene检验方差齐,F=3.380,P=0.069；采用LSD法进行组间两两比较,P值均<0.05,差异具有统计学意义。④酶标仪检测大鼠血清中睾酮(T)的水平,结果显示：对照组、模型组、治疗组分别为6.55±0.55 IU/L、0.76±0.52 IU/L、4.28±0.78 IU/L;Levene检验方差齐,F=0.277,P=0.763；采用LSD法进行组间两两比较,P值均<0.05,差异具有统计学意义；说明MSCs治疗组与模型组相比,能够升高雄性大鼠体内T的含量。⑤采用硫代巴比妥酸和黄嘌呤氧化法分别检测血清SOD的活性及MDA含量,结果显示：对照组、模型组及治疗组血清SOD的活性分别为110.0959-5.4115U/ml,64.1013±3.6994U/ml,84.2043±3.1574U/ml;Levene检验方差齐,F=1.700,P=0.224；采用LSD法进行组间两两比较,P值均<0.05,差异具有统计学意义。MDA含量分别为7.8059±1.3564nmol/ml、50.9283±3.2640nmol/ml、21.6118±0.9332nmol/ml,Levene检验方差齐,F=3.597,P=0.06；采用LSD法进行组间两两比较,P值均<0.05,差异具有统计学意义。⑥病理形态学显示：模型组与对照组比较,脑、肝脏、肾脏、脾脏、睾丸的结构破坏明显；MSCs治疗组与模型组相比,各脏器的结构得到明显改善；结论1、本实验方法能有效地获得骨髓间充质干细胞,采用贴壁法培养的骨髓细胞经鉴定为间充质干细胞。2、本实验从功能学水平、形态学水平、生化水平检测,发现MSCs具有修复和改善大鼠脏器辐射损伤的效果,说明同种异体骨髓间充质干细胞输注具有治疗大鼠辐射损伤的作用。本研究的创新点：本研究从MSCs具有多向分化潜能的干细胞特征入手,研究骨髓间充质干细胞在辐射损伤动物体内调节、修复受损的脏器,能够从根本上解决损伤脏器修复的问题；本研究的价值：本实验从MSCs多向分化潜能着手,研究同种异体骨髓MSCs输注对大鼠辐射损伤脏器的影响,为治疗辐射损伤提供了有力的实验依据,同时为MSCs的生物细胞治疗打开另一个全新的思路。