靶向常染色质的精氨酸-N,N-双丙烯酰胱胺聚合物基因载体的制备及功能性研究

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目的:含有胍基与二硫键的聚氨基胺类作为基因治疗的新型载体已经被研究,但还有一些问题存在。我们在此基础上引入一种新的物质即异染色质蛋白γ(CBX3),异染色质蛋白γ具有靶向常染色质功能,可以与裸质粒结合后被载体包载,而制备的新的载体复合物含有CBX3的精氨酸-N,N-双丙烯酰胺聚合物载体,制备成功后,将研究其在MCF-7细胞中的转染效率、细胞毒性、作用机制及靶向性等载体功能。方法:选取ARG-CBA(精氨酸-N,N-双丙烯酰胱胺)聚合物载体,包载CBX3结合的绿色荧光蛋白质粒(p IRES2-EGFP),并选取Lipofectamine 2000(Lipo)和聚乙烯亚胺(PEI)作为阳性对照载体。首先研究CBX3与质粒p DNA的结合情况,聚合物载体包载和保护CBX3-p DNA复合物的能力,使用动态光散射法(DLS)研究聚合物载体的粒径和电位特征以及用电子显微镜观察制备的载体复合物的外观特征。在MCF-7细胞中,用MTT法、荧光显微镜(FM)、流式细胞仪(FCM)等实验方法分别研究载体复合物在体外细胞的转染效率。然后采用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)对载体复合物CBX3-p DNA/ARG-CBA的体外细胞摄取过程、内涵体逃逸过程以及核定位效应进行研究,并使用流式细胞仪对基因载体复合物的体外转运机制进行研究。结果:1.CBX3-p DNA/ARG-CBA理化性质研究:琼脂糖凝胶电泳确定CBX3与p DNA的最佳结合比为1/500,将以最佳比进行后续实验;载体复合物CBX3-p DNA/ARG-CBA呈圆形状态,粒径在60nm-65nm,电位在1/24时为最大值26m V左右;在体外模拟的人体内环境中具有较强的稳定性及抵抗酶能力。2.CBX3-p DNA/ARG-CBA生物学特性:载体复合物在MCF-7细胞中的活力控制在70%~75%,高于阳性载体PEI;转染效率在1/24时已达到65%左右,均高于阳性载体。3.CBX3-p DNA/ARG-CBA的转运机制及影响转染效率研究:体外摄取实验中,载体复合物快于阳性对照组出现蓝色荧光;内涵体逃逸过程中内涵体结构较为完整与阴性对照组形态相似;在转运抑制剂作用下,CBX3-p DNA/ARG-CBA载体复合物在秋水仙碱组转染效率降低;核定位实验中载体复合物在MCF-7的蓝色荧光强度较强且分布集中。结论:CBX3-p DNA/ARG-CBA载体复合物具有优良的包载稳定性且粒径及电位合适。ARG-CBA与CBX3-p DNA在最佳质量比(1/24)条件下,在MCF-7细胞内有效递送CBX3-p DNA(p IRES2-EGFP),而且其细胞毒性仍在一个可控范围内;以及在细胞摄取载体复合物的过程中,对细胞形态影响较小且摄取的速度较快;ARG-CBA可以通过静电相互作用有效的包载外源基因,使其穿过细胞膜并快速地从内涵体逃出;其中包载的含有CBX3的ARG-CBA的复合物,p DNA在细胞核仁的量更多。这种制备的复合物具有潜在的临床应用前景。
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