牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)是感染牛的一种非常重要的致病性病原体,是引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎、流产与不孕等多种疾病的主要病原之一。国内2008年首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到Mb,此后在国内开始蔓延,目前该病原在国内外造成的经济损失巨大。在前期研究的基础之上,本文通过对全菌蛋白及膜蛋白多肽与免疫印迹的分析,旨在进一步筛选优势流行菌株,并找到具有免疫原性的抗原蛋白片段,为后期ELISA诊断试剂盒的开发、疫苗的研制提供理论依据,也为进一步预防和控制Mb及其他支原体病奠定理论基础。1牛支原体增值扩培、浓度测定及PCR鉴定本试验采用改良的支原体培养基对分离自全国各地的6株Mb分离株进行增值扩培,通过基于Mb保守基因设计的特异性引物进行PCR鉴定,并采用颜色改变单位(CCU)法对培养物进行浓度测定。结果显示,液体培养基24h开始变色,而48h即可达到对数生长期；6株分离株培养物均扩增出预期大小(1912bp)的片段；6株分离株培养物浓度均达108ccu/ml以上。研究发现改良的液体培养基比较适合Mb生长繁殖,培养时间缩短；建立的Mb PCR鉴定方法特异性好、灵敏度高、操作简单,为后期全菌蛋白和膜蛋白的研究做准备。2牛支原体分离株全菌蛋白多肽分析通过分析比较不同Mb分离株之间全菌蛋白多肽的差异性,结合前期生长特性试验和致病性试验结果进一步筛选优势流行菌株。本研究采用裂解液法对分离自全国各地的6株(分别是W70株、1738株、Q3株、Q1株、JX02株、677株)Mb分离株进行全菌蛋白的提取,通过SDS-PAGE电泳及考染分析显示6株Mb分离株全菌蛋白多肽数量、多肽清晰度存在差异；其中W70株、1738株、Q3株和Q1株的蛋白多肽条数、分子量大小及蛋白条带表达量基本一致,共有17条多肽条数,蛋白分子量范围在130.8kDa-23.2kDa之间；与前4株分离株相比,JX02株蛋白多肽条带数量与分子量大小无变化,而蛋白条带表达量低；677株蛋白多肽条带数量以及蛋白条带表达量显著低于前4株。研究表明W70株、1738株、Q3株和Q1株全菌蛋白表达量优于JX02株和677株,可以作为后期试验的候选菌株。3牛支原体分离株膜蛋白6种提取方法的比较为比较Mb膜蛋白不同提取方法的优劣,以期筛选出较优的Mb膜蛋白提取方法和提取组合参数,本研究分别采用不同浓度TritonX-100(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%).不同浓度TritonX-114(1%、2%、3%、4%).不同浓度TritonX-100与不同浓度KI (0.6M,0.8M1.8M)复合法、不同浓度TritonX-114与不同浓度KI(0.6M、0.8M、1.8M)复合法、反复冻融法、超声裂解法等6种膜蛋白提取方法提取3株Mb分离株(W70株、1738株、Q3株)膜蛋白。各法所获的膜蛋白经12%SDS-PAGE电泳和Bradford法膜蛋白定量分析表明：(1)相同膜蛋白提取法不同Mb分离株之间膜蛋白SDS-PAGE图谱无明显差异,蛋白条带数量基本相同,但相同Mb分离株不同膜蛋白提取方法所获膜蛋白SDS-PAGE图谱、蛋白条带数量和蛋白浓度差异明显(P<0.05)。(2)KI复合法提取Mb膜蛋白试验中,不同浓度KI对所获Mb膜蛋白浓度的影响差异极显著(P<0.01),0.6M KI提取的膜蛋白在蛋白条带数、蛋白条带清晰度、蛋白浓度上效果均优于0.8M KI,而0.8M KI又优于1.8M KI,1.8M KI法提取效果最差。(3)分析显示,3%tritonX-114法和0.4%TritonX-100复合0.6M KI法两法提取所获的膜蛋白蛋白条带数量较多、条带清晰度较好、蛋白浓度及蛋白收集率较高,蛋白条带数分别高达26-28条和24-28条,蛋白分子量分别在167-11.4kDa之间和170kDa-12.2kDa之间,主要蛋白分子量分别是101.4kDa、92.9kDa、85.0kDa、77.9kDa、71.3kDa、65.3kDa、45.9kDa、38.5kDa、33.8kDa、29.6kDa、27.1kDa、22.7kDa、20.8kDa和101.4kDa、92.9kDa、77.9kDa、74.5kDa、65.3kDa、59.8kDa、52.4kDa、38.5kDa、33.8kDa、29.6kDa、24.8kDa、21.6kDa、19.9kDa。(4)超声裂解及反复冻融法提取Mb膜蛋白效果一般。本研究表明3%TritonX-114或0.4%TritonX-100复合0.6M KI是Mb膜蛋白较优的提取方法；本研究为国内Mb膜蛋白的提取摸索出了一条行之有效的路径,并丰富了国外Mb膜蛋白提取方法部分的参数。4牛支原体分离株全菌蛋白及膜蛋白免疫印迹(western blot)的分析为了找到Mb全菌蛋白及膜蛋白具有免疫原性的蛋白抗原片段,为后续的Mb蛋白的研究、ELISA诊断试剂盒的开发及疫苗的研制提供理论依据。本研究采用自制的小鼠抗血清对Mb W70株、1738株、Q3株、Q1株、677株、JX02株6株分离株的全菌蛋白进行western blot分析；同时亦对3%TritonX-114法、0.4%TritonX-100复合0.6M KI法、0.4%TritonX-100法、3%TritonX-114复合0.6M KI法、反复冻融法和超声裂解法6种膜蛋白提取方法所获的W70株、1738株、Q3株3株Mb分离株膜蛋白进行western blot分析。结果显示：(1)W70株、1738株、Q3株、Q1株、JX02株和677株等6株Mb分离株全菌蛋白均显示2条相同的大小为55kDa和43kDa(误差范围±1kDa,下同)的杂交条带,且677株和JX02株杂交条带的表达量弱于其他4株分离株。(2)两种Mb膜蛋白较优提取法(即3%TritonX-114法和0.4%TritonX-100复合0.6M KI法)所获Mb W70株、1738株及Q3株3株分离株的膜蛋白均具有3条共同的杂交条带,即56kDa,43kDa和18kDa<>(3)0.4%TritonX-100,3%TritonX-114复合0.6M KI法、超声裂解法和反复冻融法所获的Mb W70株、1738株、Q3株3株分离株的膜蛋白均显现2条共同的杂交条带,分别是55kDa和43kDa。研究表明：(1)Mb各分离株全菌蛋白及膜蛋白与其抗血清反应均出现明显的杂交条带,且具有良好免疫原性；不同膜蛋白提取方法所获的膜蛋白经westem blot分析后其杂交条带数量存在差异。(2)6株Mb不同分离株的全菌蛋白和3株Mb不同分离株之间不同膜蛋白提取方法所获的膜蛋白均明显出现2条相同的westem blot杂交条带,分子量分别为55kDa和43kDa,说明55kDa和43kDa是Mb主要的抗原蛋白之一。本研究结果将为后期诊断试剂盒的研发及疫苗的研制等奠定理论基础。