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血吸虫病（Schistosomiasis）是一种被严重忽视的热带疾病,威胁全球约2亿人的健康。感染人体的血吸虫有5种,在我国,只有日本血吸虫（Schistosoma japonicum,S.japonicum）流行,主要分布于长江中游及下游流域的湖泊和沼泽地区。日本血吸虫感染终宿主后,其在宿主体内经历了不同生活史发育阶段,并可引起宿主的病理反应及造成损害。特别是当日本血吸虫虫卵大量沉积在肝脏时,可引起肝脏肉芽肿,进而引起肝脏纤维化,严重危害患者的健康。在日本血吸虫引起宿主肝脏炎症和纤维化的过程中,肝脏内的巨噬细胞发挥了重要作用。在血吸虫病急性期,巨噬细胞以经典活化为主,在肝脏内引起严重的炎症反应。在血吸虫病进入慢性期时,巨噬细胞以旁路活化为主,能够对宿主产生抗炎的保护作用,并促进纤维化的形成。肝脏中有一类起源于胚胎卵黄囊,只能依靠自我增殖进行更新补充的巨噬细胞,被称为枯否细胞（Kupffer cells,KCs）。KCs在肝窦不断逡巡,能够吞噬进入肝脏中的外界抗原物质,是保护肝脏的第一道防线。目前尚不清楚KCs在日本血吸虫致病过程中的作用。近年来,微小RNA（micro RNA,miRNA）是一个饱受关注的研究领域。miRNA是内源性1925个碱基的小片段非编码RNA。miRNA可结合到靶基因3’端非翻译区（3’UTR）,抑制靶基因m RNA的翻译或者导致靶基因m RNA降解,从而参与调控多种疾病的病理过程,如肿瘤发生、病毒感染、纤维化形成等。本研究首先检测了小鼠感染日本血吸虫前后其肝脏KCs的动态变化;在此基础上,我们筛选日本血吸虫感染后小鼠肝脏KCs内差异表达的miRNA及m RNA,并采用KEGG软件,分析这些差异表达基因的信号通路;最后对其中的一个差异表达的miRNA及其靶基因进行实验研究。首先,我们利用密度梯度离心和流式分选相结合的方法,获得正常组和感染血吸虫组小鼠的KCs。在流式分选的过程中,我们发现日本血吸虫感染后不同时间,宿主肝脏内的非实质细胞（non-parenchyma cells,NPCs）存在动态变化。我们判定F4/80hi CD11blo NPCs细胞为肝脏KCs;F4/80lo CD11bhi表型细胞为血液中募集进入肝脏的NPCs。在小鼠感染日本血吸虫的过程中,我们研究了这两群细胞的动态变化:对照组的正常小鼠中,肝脏内仅有F4/80hi CD11blo表型的KCs,且数量稳定,在肝脏NPCs中的比例维持在20%左右;而感染日本血吸虫的小鼠,其F4/80hi CD11blo KCs的比例开始为20%左右,而随着血吸虫病的进程,该KCs逐渐减少至少于1%。与此同时,从血液募集的F4/80lo CD11bhi NPCs细胞群,在感染4周后出现,其数量急剧增加并在感染后期保持稳定。肝脏内NPCs随着日本血吸虫的感染时间而动态变化,提示我们在日本血吸虫的不同致病阶段中,可能有不同的非实质细胞参与其中,发挥相应的功能。为了进一步探讨F4/80hi CD11blo KCs在日本血吸虫感染过程逐渐减少的内在因素,我们采用miRNA芯片和深度测序的方法,分析日本血吸虫感染前后宿主KCs miRNA和m RNA表达谱,并鉴定出差异表达的miRNA和m RNA。实验取日本血吸虫感染后第6周的小鼠以及正常对照组小鼠,分离两组小鼠肝脏的F4/80hi CD11blo KCs样本,提取miRNA和总RNA,分别进行miRNA芯片检测和转录本测序。miRNA芯片检测结果经分析显示:共获得63个差异表达3倍以上的miRNA,其中上调表达miRNA 51个,下调表达miRNA 12个。随机挑选其中20个差异表达的miRNA进行实验验证,经实时荧光定量PCR（quantitative real time PCR,q RT-PCR）验证,其中17个和芯片检测结果趋势一致。通过转录本测序和分析,我们从中筛选到差异表达2倍以上的基因共1083个,其中上调表达494个,下调表达589个。采用KEGG软件分析,这些差异表达基因分属于T细胞受体信号通路、趋化因子信号通路等10个信号通路。选取趋化因子相关通路进行q RT-PCR验证,其结果和转录本测序结果趋势一致。我们进一步在感染后4至9周不同时间点的感染组和对照组样本中检测CCL3、CCL4、CCL7等趋化因子,结果显示,这些趋化因子在感染后不同时间点均上调表达,提示我们日本血吸虫感染后,肝脏内NPCs的动态变化可能与趋化因子的增加有关。在临床研究中发现,肝癌病人KCs中,CX3CR1的表达下调。同时,肝脏内KCs中抗凋亡基因Bcl2表达下调,细胞有凋亡的趋势。在四氯化碳（CCL4）诱导小鼠肝纤维化模型的研究中,当CX3CR1敲除后,小鼠肝脏的纤维化更加严重。趋化因子受体CX3CR1能够介导胞外促生存信号传递到胞内,也能够影响肝脏的纤维化,但是二者之间是否存在关联、其中的具体机制目前尚不明确。从转录本测序结果中我们发现,日本血吸虫感染后趋化因子受体CX3CR1的表达与正常小鼠相比有显著下降。与此同时,我们发现感染后小鼠肝脏KCs中mi R-297a-5p显著升高。通过在线靶基因预测,在CX3CR1基因的3’端非翻译区（untranslated region）存在mi R-297a-5p的作用靶点。因此,我们对CX3CR1在日本血吸虫感染后F4/80hi CD11blo KCs减少中的作用以及与mi R-297a-5p的靶向关系开展了进一步研究。我们采用q RT-PCR方法,检测日本血吸虫感染后不同时间点感染组和对照组F4/80hi CD11blo KCs RNA样本,结果显示感染后CX3CR1的表达呈显著下调,mi R-297a-5p表达逐渐增加。此外,感染组和对照组F4/80hi CD11blo KCs表面CX3CR1流式分析结果显示,感染组KCs表面CX3CR1蛋白表达下调,而对照组CX3CR1蛋白表达没有显著变化。为验证CX3CR1与mi R-297a-5p之间的靶向关系,我们利用双荧光报告系统进行了检测。首先,我们依据在线预测的靶向结合位点,合成了野生型CX3CR1 3’UTR结合位点和突变型结合位点,并插入到带有荧光基因的报告载体上。将mi R-297a-5p模拟物（mimics）、野生型和突变型报告载体分别转染到HEK-293T细胞中,培养48小时。经检测,mi R-297a-5p高表达后,野生型CX3CR1 3’UTR载体报告基因的荧光表达会显著下调（p<0.05）,但是突变型CX3CR1 3’UTR载体报告基因的表达没有显著（p>0.05）的变化。为进一步研究KCs内差异表达的mi R-297a-5p及其靶基因CX3CR1在日本血吸虫致病过程中的作用,我们利用巨噬细胞系,在体外对mi R-297a-5p及CX3CR1进行了初步的功能研究。我们利用电转染的方法,将不同浓度的mi R-297a-5p mimics分别转染到KCs细胞系和RAW264.7细胞系中。q RT-PCR检测,mi R-297a-5p表达量显著提高,并能够有效抑制CX3CR1 m RNA的表达。进一步利用流式检测的方法,对转染细胞表面CX3CR1蛋白表达以及凋亡情况进行检测。检测结果显示,细胞表面CX3CR1蛋白表达无变化,而且也并未呈现凋亡的现象。在本课题的研究中,我们发现日本血吸虫感染后,肝脏内NPCs动态变化。其动态变化与日本血吸虫致病过程有紧密关联。我们筛选出了日本血吸虫感染后KCs中差异表达的miRNA和m RNA。对mi R-297a-5p和CX3CR1的靶向关系及功能进行了体外初步研究。本课题为进一步研究KCs在日本血吸虫致病过程中的作用奠定了基础。