【摘 要】
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目的:从人参中寻找能促进成肌分化缓解糖尿病性肌萎缩的有效成分,并利用糖尿病果蝇模型明确其缓解糖尿病性肌萎缩的功效,且通过小鼠肌萎缩细胞模型深入探究其缓解糖尿病性肌萎缩的作用机制。方法:(1)采用溶剂浸提及层析、膜过滤等多种制备技术对人参根/茎叶主要组分进行提取分离和纯化,并使用分光光度法对其成分和含量进行测定。(2)将这些组分分别作用于分化中的小鼠C2C12成肌细胞,通过免疫印迹技术(WB)检测其
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目的:从人参中寻找能促进成肌分化缓解糖尿病性肌萎缩的有效成分,并利用糖尿病果蝇模型明确其缓解糖尿病性肌萎缩的功效,且通过小鼠肌萎缩细胞模型深入探究其缓解糖尿病性肌萎缩的作用机制。方法:(1)采用溶剂浸提及层析、膜过滤等多种制备技术对人参根/茎叶主要组分进行提取分离和纯化,并使用分光光度法对其成分和含量进行测定。(2)将这些组分分别作用于分化中的小鼠C2C12成肌细胞,通过免疫印迹技术(WB)检测其对于成肌分化标志蛋白肌细胞生成素(myogenin)表达的影响,寻找到人参促成肌分化的功效组分。(3)通过高效液相(HPLC)分析上述功效组分中所含单体的种类及含量,通过WB和免疫荧光检测其对myogenin、肌球蛋白重链(MHC)、生肌调节因子(Myo D)和肌源性因子(Myf5)表达的影响,确定促成肌细胞分化的活性单体成分。(4)将该单体成分作用于高糖饮食喂养的糖尿病黑腹果蝇模型,分光光度法检测其对果蝇海藻糖和甘油三酯含量的影响,利用攀爬实验测定攀爬距离评价果蝇的攀爬能力,通过甲苯胺蓝染色观察肌纤维直径并使用Image J软件统计肌纤维面积,明确其对于糖尿病性肌萎缩的缓解功效。(5)使用葡萄糖作用于分化中的C2C12成肌细胞建立肌萎缩模型,将这一单体成分作用于该模型,通过姬姆萨染色观察肌管直径并使用Image J软件统计肌管面积;同时通过WB结合免疫荧光检测肌萎缩标志蛋白肌肉环状指蛋白1(Mu RF1)和肌肉萎缩盒F蛋白(atrogin-1)评价其对于葡萄糖引起肌萎缩的功效,并通过检测成肌分化因子myogenin、MHC、Myo D和Myf5的表达评价其对于肌萎缩模型成肌分化的影响;WB检测调控成肌分化的信号通路AMPK/Smad3/Fox O3并使用AMPK的抑制剂CC对实验结果进行验证。(6)使用地塞米松作用于分化成熟的C2C12肌管细胞建立肌萎缩模型,通过肌管面积和Mu RF1、atrogin-1的检测评价肌萎缩情况,通过myogenin、MHC、Myo D、Myf5的表达评价成肌分化情况,WB结合免疫荧光检测调控成肌分化的信号通路Akt/m TOR/Fox O3并使用Akt的抑制剂GDC-0068对实验结果进行验证。结果:(1)从人参根/茎叶中分别制备出了人参根总皂苷、人参茎叶总皂苷、人参蛋白以及人参酚酸提取物。(2)人参根总皂苷能够显著提高C2C12成肌细胞中myogenin的表达,因此接下来对于人参根总皂苷中皂苷单体种类及功效进行了研究。(3)HPLC检测发现人参根皂苷中主要含有19种皂苷单体,结合查阅文献锁定与本研究相关性较高的9种皂苷单体Rb1,Rc,Rb2,Re,Rb3,Rg1,S-Rg3,R-Rg3和Rd进行实验,发现S-Rg3和Rg1对小鼠C2C12成肌细胞中MHC和myogenin的表达有显著促进作用,通过对Myf5的检测发现S-Rg3效果优于Rg1,因此下一步实验选用了S-Rg3作为研究对象,并且发现不同浓度S-Rg3对C2C12成肌细胞myogenin、MHC、Myo D和Myf5的表达均有促进作用。(4)使用S-Rg3喂养糖尿病果蝇发现其能降低糖尿病果蝇的海藻糖和甘油三酯含量、提高糖尿病果蝇的攀爬能力、恢复肌纤维损伤,说明S-Rg3能够缓解糖尿病果蝇的肌萎缩。(5)S-Rg3作用于葡萄糖诱导的肌萎缩细胞能提高肌管直径、降低Mu RF1和atrogin-1的表达;并且S-Rg3能增加模型细胞中myogenin、MHC、Myo D和Myf5的表达;S-Rg3能够促进AMPK磷酸化、抑制Smad3磷酸化、促进Fox O3磷酸化,加入AMPK特异性抑制剂CC后发现S-Rg3对模型组细胞AMPK、Smad3和Fox O3的磷酸化均无显著影响。(6)S-Rg3作用于地塞米松诱导的肌萎缩细胞能提高肌管直径、降低Mu RF1和atrogin-1的表达;并且S-Rg3能增加模型细胞中myogenin、MHC、Myo D和Myf5的表达;S-Rg3能够促进Akt和m TOR磷酸化、抑制Fox O3核易位,加入Akt特异性抑制剂GDC-0068后发现S-Rg3对模型组细胞的Akt/m TOR磷酸化和Fox O3核易位均无显著影响。结论:通过对成肌分化进行检测发现人参根总皂苷中的单体S-Rg3具有较好的促成肌分化效果且S-Rg3能缓解糖尿病果蝇的肌萎缩,S-Rg3可能是通过调控AMPK/Smad3和Akt/m TOR信号通路抑制Fox O3核易位来促进成肌分化缓解葡萄糖和地塞米松引起的肌萎缩,S-Rg3可能对2型糖尿病和继发性糖尿病诱发的肌萎缩有缓解作用。
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