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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属成员，主要引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等临床症状。给养猪业造成了严重的经济损失。本研究成功建立了基于副猪嗜血杆菌16S rRNAPCR和荧光定量PCR检测方法，并且在对临床上进行初步应用。根据HPS的16S rRNA保守区基因序列，设计2对特异性引物，以HPSDNA为模板，建立了HPS Nest-PCR检测方法通过对引物浓度、dNTPs以及退火温度等反应条件的优化，同时对Nest-PCR检测方法进行了特异性、重复性和敏感性试验。对疑似感染副猪嗜血杆菌的临床样品进行了应用检测，并对检测到的阳性样品进行了测序。根据GenBank已登录的中的HPS16S rRNA保守部分基因序列设计合成特异性引物和MGB荧光探针，以定量10倍系列稀释的重组质粒为标准品，进行FQ-PCR扩增并绘制了标准曲线，经过对引物浓度、探针浓度以及退火温度等进行优化，建立了HPS的MGB探针实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测方法。对所建立的FQ-PCR检测方法进行了特异性、敏感性和重复性试验，并对疑似副猪嗜血杆菌病临床样品进行了应用检测，同时与普通PCR方法进行了对比实验。结果：成功建立了HPS Nest-PCR诊断方法，通过对副猪嗜血杆菌5型、猪链球菌2型、猪圆环病毒、猪传染性胸膜肺炎放线菌等病原体检测，仅副猪嗜血杆菌5型在305bp左右扩增出条带，而其它未出现条带，对副猪嗜血杆菌15个血清型检测均为阳性，表明该方法对HPS具有良好的特异性，不与其它病原发生交叉反应；Nest-PCR比常规PCR灵敏度高10倍，具有较好的稳定性和重复性；临床应用表明本方法的建立实现了对HPS的快速诊断。所建立的FQ-PCR检测方法标准曲线的循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系，相关系数为0.997；建立的HPS FQ-PCR检测方法灵敏度可达1.98×10~1拷贝/μL，比普通PCR灵敏度高；重复性好，对不同浓度的重组质粒进行4次扩增，批内与批间重复试验变异系数均小于2.5%。表明该方法具有良好的重复性。该方法对副猪嗜血杆菌进行扩增，呈阳性反应，而其他6个病原体扩增均为阴性反应，对副猪嗜血杆菌15个血清型扩增均为阳性反应，证明该方法特异性强。对15份临床疑似副猪嗜血杆菌感染猪组织病料进行了应用检测，结果11份为阳性，与Nest-PCR诊断方法的阳性符合率为100%。