【摘 要】
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无论是人类还是动物界,都面临着病原微生物的威胁,其中主要以细菌和病毒的危害性较大。及时准确的检测对于科学防控病原传播具有极其重要的意义。作为目前实验室最常用的核酸检测技术,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）已广泛应用于病原微生物的检测。然而,PCR方法要么依赖存在染料使用安全风险的琼脂糖凝胶电泳,要么需使用成本较高的荧光定量设备及配套试剂,且不适于现场即时
【基金项目】
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国家自然科学基金委； 国家重点研发计划课题（2017YFA0205502）； 创新研究群体科学基金（61821002）； 中央高校基本科研基金（2242020k10017）；
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无论是人类还是动物界,都面临着病原微生物的威胁,其中主要以细菌和病毒的危害性较大。及时准确的检测对于科学防控病原传播具有极其重要的意义。作为目前实验室最常用的核酸检测技术,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）已广泛应用于病原微生物的检测。然而,PCR方法要么依赖存在染料使用安全风险的琼脂糖凝胶电泳,要么需使用成本较高的荧光定量设备及配套试剂,且不适于现场即时检测（point-of-care testing,POCT）。近年来发展起来的等温扩增技术突破传统核酸体外扩增的固有限制,弥补了PCR方法在POCT应用方面的短板,但现有方法在引物设计、目标序列及灵敏度等方面仍有局限性,距离广泛应用仍有差距。此外,作为核酸检测的重要步骤,不同类型样本的DNA常规提取方法缺乏通用性,步骤冗繁,且提取的DNA质量也有待提高。针对上述问题,本研究在核酸提取与纯化、常规PCR、等温扩增等方面进行了试剂改良与方法创新。同时,针对不同应用条件下DNA/RNA检测需求,基于荧光免疫层析分别建立定量方法并应用于病原微生物的检测。主要工作如下:（1）基于磁珠的通用型DNA提取及纯化方法的建立。本研究通过优化实验,优选硅羟基磁珠为DNA提取磁珠。在CTAB法裂解液中加入40μL SDS溶液（15%,w/v）进行试剂改良。优选异丙醇为结合液,磁珠优选用量为40μL（30 mg/m L）,最后使用65℃进行洗脱。经实验验证,本研究方法可从多种类型的样本中高效、优质提取基因组DNA。接着,为了对PCR产物进行纯化,避免引物二聚体等对PCR定量产生干扰,建立了一种基于磁珠的核酸纯化方法。通过实验探索确定吸附液体积、PEG-8000工作浓度及Na Cl浓度对不同长度DNA片段的纯化作用,并通过肠炎沙门氏菌PCR产物进行了成功验证。（2）基于荧光免疫层析的PCR定量方法建立及在犬细小病毒2型检测中的应用。使用荧光微球作为荧光信号放大探针,提高了检测的灵敏度。运行缓冲液的优选工作体积为80μL、免疫层析检测时间为2 min。使用磁珠法对PCR产物进行纯化,有效解决了引物二聚体等导致的假阳性问题。该方法能特异性检测犬细小病毒2型,其cutoff值为146（荧光信号值）。检测灵敏度为30 copies/μL,比常规PCR高2个数量级。通过62份临床样品验证,检测结果与常规PCR一致。同时,通过对阳性样本VP2基因测序分析,确定病毒株的抗原类型。该方法操作安全、简单快速,检测结果可实现数字化定量。（3）基于荧光免疫层析的链交换等温扩增定量方法建立及在沙门氏菌检测中的应用。以重要食源性致病菌沙门氏菌为研究对象,通过对链交换等温扩增产物酶切和DNA测序验证了方法的准确性,并对扩增机制进行了分析。基于荧光免疫层析,核酸检测可在30 min内完成,其cutoff值为15,灵敏度为6 CFU/m L（纯培养物）或3×10~4 CFU/25 g（人工感染物）。特异性经89株沙门氏菌和15株非沙门氏菌参考株验证。对236份样品进行检测,结果与常规PCR一致。该方法简单、快速、灵敏且特异,适于病原微生物快速检测（POCT）。（4）基于荧光免疫层析的三引物增强链交换等温扩增定量方法建立及在新型冠状病毒检测中的应用。为提高对RNA的扩增效率以快速检测SARS-Co V-2,建立了一种三引物增强链交换等温扩增方法。通过酶切和DNA测序验证了方法的准确性,并对反应机制进行了分析。基于荧光免疫层析,可在1 h内实现定量检测。Rd RP和N基因扩增可在相同条件下进行,结果重复性好,灵敏度分别为90 copies/μL和70 copies/μL。本方法可特异性检测SARS-Co V-2,与其他临床症状相似的病毒和致病菌无交叉反应。模拟病毒感染物实验表明,Rd RP和N基因检测方法灵敏度分别为200 copies/m L和90 copies/m L,cutoff值分别为11和12。综上,基于磁珠的通用型DNA高效提取方法为核酸检测提供了高质量模板,PCR产物纯化方法为解决引物二聚体等干扰提供了方法支持。PCR定量方法为改进常规PCR提供了新的技术方案。链交换等温扩增方法弥补了现有方法在检测短序列靶标时的短板,且适于POCT应用。这两种定量方法可满足不同序列长度的核酸检测需求。三引物增强链交换等温扩增方法为高效检测RNA病原体提供了新的有力手段。本研究为实验室及POCT等不同应用条件下对不同类型的病原体进行核酸快速检测提供了针对性的解决方案。所建立的方法操作简单、安全、快速、灵敏、可数字化定量且适于推广使用,具有重要的实际应用价值。
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