背景与目的肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤，化疗是治疗肺癌的主要手段之一，尽管对肺癌的化疗取得了一定进展，但过去25年其5年生存率仍未见显著提高，约为15%，而多药耐药(MDR)是肺癌化疗失败的主要原因之一。在肺癌化疗中，顺铂(CDDP)是有效并广泛应用的一线药物，但由于耐药问题的存在使其疗效不尽如人意。顺铂是一种细胞周期非特异性的细胞毒药物，目前认为抗癌细胞凋亡、损伤修复过程中DNA剪切物的增加、与调控信号通路相关的调节蛋白表达的改变、药物摄取减少导致细胞内CDDP浓度降低等均可能与顺铂的耐药有关，然而肺癌细胞对其耐药的机制尚未完全阐明。因此，进一步研究顺铂的耐药机制和寻找新的逆转耐药靶点对于改善肺癌化疗效果提高5年生存率具有重要意义。抗细胞凋亡是顺铂耐药的主要机制之一，而PI3K/AKT通路是最主要的抗凋亡通路。我们前期研究发现AKT1的过表达和基因扩增与肺癌细胞对顺铂耐药密切相关，抑制AKT1的表达可以逆转A549/CDDP对顺铂的耐药，反之，激活AKT1则可增强肺癌细胞对CDDP的耐受；采用PI3K的抑制剂LY294002能显著抑制AKT1的表达并增强耐药细胞A549/CDDP对顺铂的敏感性。Ras基因位于PI3K/AKT通路的上游，既往研究表明调控Ras有关的上游调控分子如EGFR、HER2、Grb2、鸟苷酸交换因子(GEF，如SOS1)等均为SHP2作用的底物，一方面，SHP2通过与上述底物结合激活Ras；另一方面，SHP2通过与RasGAP结合阻止GTP酶对Ras-GTP的水解延长RAS-GTP的半衰期，从而使下游信号通路包括PI3K/AKT通路处于持续激活状态。同时，我们前期在乳腺癌的研究中发现，抑制SHP2表达的同时也可以抑制AKT的表达，最近的研究又表明顺铂可以选择性的活化SHP2，因此我们推测SHP2可能是一新的肺癌顺铂耐药相关蛋白，其机制是通过Ras调控PI3K/AKT信号通路实现的。SHP2是一种含有两个Src同源结构域(Src homology-2，SH2)的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)，是PTP超家族中第一个原癌基因PTPN11编码的蛋白产物。蛋白酪氨酸磷酸化在细胞信号转导过程中具有重要作用，酪氨酸磷酸化水平受控于蛋白酪氨酸激酶(PTK)及PTP，二者的失衡会导致异常的酪氨酸磷酸化，而异常的酪氨酸磷酸化与人类多种疾病包括癌症密切相关。研究表明，SHP2的活化突变或持续激活是青少年粒-单核细胞性白血病、髓细胞性白血病、慢性粒-单核细胞性白血病的病因，它也参与了幽门螺旋杆菌相关胃癌的发生，在胃癌、乳腺癌中也有SHP2的高表达，但目前SHP2与癌症关系的研究主要集中在癌症发生及癌细胞生长、侵袭、迁移、转化方面，尚未发现SHP2与肺癌顺铂耐药的相关研究报道。本课题拟通过组织芯片和免疫组织/细胞化学技术，首先检测SHP2在人肺癌中的表达情况；然后以顺铂诱导的小细胞肺癌MDR细胞H446/CDDP及其亲代细胞H446为研究对象，利用基因克隆及RNA干扰技术，构建SHP2慢病毒表达或干扰载体，在增强H446细胞中SHP2的表达或下调H446/CDDP细胞中SHP2的表达的情况下，分别观察在加入顺铂前后细胞生物学行为及对顺铂耐药的变化，了解SHP2是否与肺癌顺铂耐药有关；最后，在初步证实SHP2是一新的肺癌顺铂耐药相关蛋白的前提下，检测Ras干扰前后各组细胞SHP2、Ras、AKT1、pAKT1及survivin蛋白表达情况，初步阐明SHP2影响肺癌顺铂耐药的分子机制。方法1、应用组织芯片及免疫组织/细胞化学技术，检测SHP2在人肺癌组织、小细胞肺癌细胞H446及肺腺癌细胞SPC-A-1的亲代及顺铂诱导的MDR细胞中的表达；2、应用基因克隆及RNA干扰技术，构建SHP2慢病毒表达载体及干扰载体，293FT细胞慢病毒包装，收集病毒后用于感染H446及H446/CDDP细胞，采用嘌呤霉素浓度筛选获取稳定高表达SHP2的H446细胞(H446-SHP2-WT)及持续抑制SHP2表达的H446/CDDP细胞(H446/CDDP-SHP2-shRNA)，并用RT-PCR及Western blot进行鉴定；3、应用CCK-8法检测筛选细胞对顺铂的敏感性，并在加入顺铂前后观察各组细胞生长曲线的变化；4、应用流式细胞仪检测各组细胞在加入顺铂前后细胞周期及凋亡的改变；5、应用Western blot及RNA干扰技术，观察Ras RNA干扰前后各组细胞SHP2、Ras、AKT1、pAKT1、survivin的表达情况。结果1、SHP2在80例NSCLC组织中有较高阳性表达率[70.00%(56/80)]，SHP2在小细胞肺癌细胞H446及肺腺癌细胞SPC-A-1的亲代及顺铂诱导的MDR细胞中均呈阳性表达；2、成功构建了SHP2慢病毒表达载体及干扰载体，筛选出了稳定高表达SHP2的H446细胞(H446-SHP2-WT)及持续抑制SHP2表达的H446/CDDP细胞(H446/CDDP-SHP2-shRNA)；3、H446-SHP2-WT-空载、H446-SHP2-WT对顺铂IC50值分别为1.01μg/ml、1.218μg/ml，耐药指数为1.206， H446-SHP2-WT对顺铂的耐受性增强20.6%；H446/CDDP-SHP2-shRNA、H446/CDDP-SHP2-shRNA-空载对顺铂的IC50值分别为4.382μg/ml、11.92μg/ml，耐药指数为2.72，H446/CDDP-SHP2-shRNA对顺铂的耐药逆转率为63.2%，表明增加SHP2的表达可降低H446细胞对顺铂的敏感性，而抑制SHP2的表达可逆转H446/CDDP细胞对顺铂的耐受，初步证实SHP2是一新的肺癌顺铂耐药相关蛋白；4、 H446-SHP2-WT细胞在加入顺铂后细胞生长受抑制程度弱于H446及H446-SHP2-WT-空载组，第2天及第3天明显(p＜0.05)，而H446/CDDP-SHP2-shRNA细胞在加入顺铂后细胞生长受抑制程度强于H446/CDDP及H446/CDDP-SHP2-shRNA-空载组，第3天以后明显(p＜0.05)；流式细胞仪检测发现加入顺铂后可使各组细胞停留在S期的细胞比例显著增加，H446-SHP2-WT细胞在顺铂作用条件下凋亡细胞比例减少(34.56%vs49.43%)，而H446/CDDP-SHP2-shRNA细胞在顺铂作用条件下凋亡细胞比例明显增加(16.75%vs6.60%)。上述结果进一步证实SHP2为一新的肺癌顺铂耐药相关蛋白，其对顺铂耐药的影响可能与其调控肺癌细胞的凋亡有关；5、亲代细胞H446及顺铂诱导的MDR细胞H446/CDDP的SHP2蛋白表达无明显差异，但MDR细胞H446/CDDP的SHP2活性明显高于亲代细胞H446(OD值分别为0.488±0.015和0.249±0.011，p＜0.05)，表明H446/CDDP细胞对顺铂的耐药性还与SHP2的活性增加有关；6、H446/CDDP、H446/CDDP-SHP2-shRNA-空载的Ras、AKT1、pAKT1、survivin的表达高于亲代细胞H446； H446/CDDP、 H446/CDDP-SHP2-shRNA-空载、H446/CDDP-SHP2-shRNA细胞Ras、AKT1、pAKT1、survivin表达变化情况与SHP2变化情况一致，抑制SHP2的表达可下调Ras、AKT1、pAKT1、survivin的表达，提示SHP2可能是Ras、AKT1、survivin的上游调控因子，并在PI3K/AKT1通路中具有正向调节作用；SHP2表达未抑制的H446、H446/CDDP、H446/CDDP-SHP2-shRNA-空载细胞加入顺铂后pAKT1、survivin的表达增加，而SHP2表达抑制的H446/CDDP-SHP2-shRNA细胞加入顺铂前后pAKT1、survivin表达无明显变化，提示顺铂可能活化SHP2并通过SHP2/Ras/PI3K/AKT1/survivin抑制细胞的凋亡而参与耐药；7、在顺铂作用条件下，H446、H446-SHP2-WT、H446/CDDP Ras RNA干扰组Ras表达下降，而SHP2表达无明显变化，提示SHP2位于Ras的上游；同时发现AKT1及pAKT1在H446-SHP2-WT及H446/CDDP Ras RNA干扰组的表达增高，提示活化的SHP2不仅仅通过Ras调控PI3K/AKT1通路影响细胞的凋亡参与肺癌的耐药，可能还存在其他的补偿途径增加AKT1及pAKT1的表达。结论1、SHP2在人肺癌中具有高表达率；2、SHP2是一新的肺癌顺铂耐药相关蛋白，其对肺癌顺铂耐药的影响既与其表达水平有关，也与其活性有关；3、SHP2对肺癌顺铂耐药的影响与其调控肺癌细胞的凋亡有关，其机制之一是SHP2作为Ras的上游调控分子通过SHP2/Ras/PI3K/AKT1/survivin信号通路抑制细胞凋亡实现的，并且SHP2在此通路中具有正向调节作用。