本研究以漠斑牙鲆（Paralichthys lethostigma）为研究对象，运用组织学方法、数量形态测量法、酶联免疫双抗体夹心法测定（ELISA）、cDNA末端快速扩增（RACE）技术和半定量PCR法对漠斑牙鲆亲鱼卵巢年周期发育成熟的生理特征、血浆性类固醇激素和促性腺激素表达水平的周年变化规律、促性腺激素FSHβ亚基和LHβ亚基的克隆及其在生殖调控中的生理作用机制等进行了全面研究，初步认识了人工养殖条件下漠斑牙鲆亲鱼的繁殖生理和内分泌特性，为构建稳定的漠斑牙鲆人工繁育技术提供了理论支撑和技术依据。相关研究结果如下：1.漠斑牙鲆卵巢年周期发育规律组织学观察表明，漠斑牙鲆属于一年一次成熟、性腺非同步发育分批产卵类型。生活史中，卵母细胞按其组织学特点可分为6个时相,卵巢发育依据其形态特征可划分为相应的6个时期。达性成熟年龄的雌性亲鱼年周期发育过程中仅可见5个不同发育时相的卵母细胞，卵巢的年发育周期可相应分为5个时期。卵巢年周期发育过程中,亲鱼的性腺指数（GSI）、肝脏指数（HSI）和肥满度（CF）发生变化,表现出与性腺发育的组织学特征协同一致的变化规律。其中，GSI值在12月份达到最大值20.87，在6月份达到最低值1.06。HSI值在11月份达到最大值4.92，在12月份达到最低值1.14，CF值在11月份达到最大值2.27。本研究揭示了漠斑牙鲆卵巢的年周期发育规律，包括卵巢形态变化、卵母细胞组织特征变化和卵巢发育的数量特征变化，认识了漠斑牙鲆卵巢年周期发育的生理和数量形态特征。2.漠斑牙鲆雌鱼血浆性类固醇激素及促性腺激素表达水平的周年变化采用ELISA测定方法测定了漠斑牙鲆卵巢年周期发育过程中血浆性类固醇激素-雌二醇（E₂）、睾酮（T）、孕酮（P）表达水平和促性腺激素-促卵泡素（FSH）和促黄体素（LH）表达水平的变化。结果表明：漠斑牙鲆血浆中性类固醇激素的含量表达水平呈现季节性变化的规律且与性腺发育密切相关。漠斑牙鲆血浆中E₂、T、P、FSH和LH的表达水平的周年变化各不相同，表达水平曲线中都出现了两个峰值。其中，E₂的表达水平在6月份和12月份分别出现一个高峰，6月份表达水平最大值为7.43pg/mL，12月份表达水平最大值为6.67pg/mL，其他月份E₂表达水平均保持相对较低水平，最低值出现在繁殖期末期的2月份，血浆E₂表达水平含量仅为4.34pg/mL。4-6月份和10-12月份血浆E₂表达水平逐渐升高，整体趋势与温度变化趋势保持一致，在一定范围内随着温度的升高血浆中E₂的表达水平逐渐升高。水温调节对血浆中E₂的表达水平影响差异极显著并与其呈正相关关系。漠斑牙鲆血浆中T表达水平的周年变化不大，最高值出现在繁殖期前的11月份，最高表达水平达377.84pg/ml，表达水平最低值出现在繁殖期结束后的3月份（307.24pg/ml）。水温调节对血浆中T的表达水平影响差异不显著并与其呈正相关关系。血浆中T的表达水平比E₂表达水平提前一个月达到高峰，可能是因为T和E₂在芳香化酶的作用下相互转化引起的。漠斑牙鲆血浆中孕酮的表达水平周年变化明显，表达水平峰值出现在7月份和1月份，峰值分别为23.76ng/mL和23.54ng/mL，表达水平最低值出现在3月份，浓度为14.88ng/mL。漠斑牙鲆血浆中P的表达水平峰值出现时间都比E₂表达水平峰值出现时间晚一个月。统计分析表明，水温调节对血浆中P的表达水平影响差异不显著并与其呈负相关关系。血浆FSH表达水平周年变化明显，表达水平峰值出现在7月份和1月份，峰值分别为6.37IU/L和5.31IU/L。而LH表达水平周年变化明显，表达水平峰值出现在6月份和12月份，峰值分别为20.71IU/L和20.39IU/L。利用外源缓释激素鲑鱼促性腺激素释放激素（sGnRH）对性腺已发育至Ⅳ期中后期的漠斑牙鲆雌鱼进行催产试验，结果表明：外源激素sGnRH诱导后，首先作用于垂体促性腺激素，促进FSH和LH表达水平在96h升高，同时血浆P表达水平升高，然后在144h血浆E₂表达水平升高而睾酮表达水平降低。在激素效应72h后进行人工采卵受精获得了良好的卵子和受精效果。通过对这几种性类固醇激素和促性腺激素在漠斑牙鲆卵巢年周期发育过程中表达水平变化的研究，初步认识了漠斑牙鲆生殖调控的内分泌基础，为建立人工催产技术奠定了坚实的理论基础。3.促性腺激素基因的克隆与表达分析为了从基因水平认识促性腺激素在漠斑牙鲆生殖调控中的作用机制，利用RACE方法在漠斑牙鲆垂体中克隆到FSHβ亚基和LHβ亚基的cDNA序列全长，已经提交至GenBank数据库，获取号分别为FSH（GenBank NO.JX002657）,LH（GenBankNO.JX002656）。相关研究结果如下：FSHβ亚基的cDNA序列全长625bp，编码120个氨基酸，包括一个长363bp的开放阅读框（ORF），一个107bp的5’非编码区，一个155bp的3’非编码区，一个终止密码子（TGA）。预测的蛋白分子量为12918.88m.w.，等电点为5.52。另外，在FSHβ亚基氨基酸序列中发现了两个N-连接糖基化位点。LHβ亚基的cDNA序列全长为597bp，编码145个氨基酸，包括一个长438bp的开放阅读框（ORF），一个72bp的5’非编码区，一个87bp的3’非编码区，一个终止密码子（TGA）。预测的蛋白分子量为16383.31m.w.，等电点为5.58。在LHβ亚基氨基酸序列靠近蛋白的C端中发现一个N-连接糖基化位点。漠斑牙鲆FSHβ亚基和LHβ亚基氨基酸序列均与鲽形目鱼类中牙鲆的氨基酸同源性最高，分别达到95.9%和97.9%，其次与鲈形目鱼类氨基酸同源性分别为76.9%和74.5%。对漠斑牙鲆FSHβ亚基和LHβ亚基进行了组织表达研究表明：FSHβ亚基仅在垂体中表达，而LHβ亚基在除了肌肉以外的垂体、脑、性腺、肝、心、脾、肾、胃、肠、鳃中均有表达，但在各组织的表达量不同，表明LHβ亚基除了参与卵母细胞的发育成熟调控之外，它可能还具有更为广泛的生理功能。4.促性腺激素基因的季节表达水平变化与卵巢发育的关系研究了漠斑牙鲆卵巢年发育周期过程中FSHβ亚基在垂体及LHβ亚基在垂体、脑、肝脏、性腺中的季节表达水平的变化规律。结果表明：FSHβ亚基在性腺发育早期表达量较低，其后随着卵巢的发育成熟，垂体中FSHβ亚基表达水平逐渐增加，在产卵前期的12月份达到峰值。而垂体中LHβ亚基在整个性腺发育过程中都保持较高的表达水平，但是在产卵期的1月份达到峰值，表明其在性腺成熟中可能起着更为重要的调控作用。同时，脑中LHβ亚基表达水平同样随着卵巢的不断发育而升高，自10月份后保持较高水平，并在12月份达到最高；性腺中LHβ表达水平表现出两个明显的峰值，分别出现在6月份和12月份，这与性类固醇激素的雌二醇表达水平的表达规律一致。肝脏中的LHβ表达水平在7月达到最高，其他月份保持相对较低水平。LH在脑、垂体、性腺和肝脏中的广泛表达及其在卵巢成熟过程中的表达水平变化表明，LH可能通过不同的信号通路对漠斑牙鲆的性腺发育起生理调控作用。结合卵巢发育的组织学特征和血浆性类固醇激素、促性腺激素的表达水平变化规律，发现漠斑牙鲆卵巢发育过程中FSHβ和LHβ亚基mRNA的表达水平变化与组织学观察和激素表达的结果相一致。本研究从基因水平认识了促性腺激素基因在漠斑牙鲆卵巢发育成熟调控中的生理作用。