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锌离子(Zn2+)是机体重要的功能因子,具有广泛的生理功能。近年来的研究资料认为Zn2+的大量释放与缺血性脑卒中致神经死亡有关。本文主要采用培养的PC12细胞和大鼠大脑皮层神经元,通过体外实验观测过量锌对神经细胞钾通道电流的影响,以及特异性的锌离子螯合剂(TPEN)的逆转效应。以探讨锌离子在缺血性脑卒中发生过程中的病理生理学意义及其螯合剂TPEN对缺血性脑卒中的保护作用与机理。
1.不同浓度锌离子对培养的PC12细胞生长状况的影响:在培养的PC12细胞外液中分别加入不同浓度(20μmol/L,40μmol/L,60μmol/L,80μmol/L,100μmol/L)的锌离子,24小时后观测其对细胞生长状态的影响。结果:20、40μmol/L的锌对PC12细胞的作用不明显;60μmol/L的锌作用下,细胞开始发生异常,细胞形态皱缩、部分突起消失、折光率发生改变等;80μmol/L的锌作用下此现象更加明显且存活率锐减,已观察到有死亡细胞漂浮于培养基中;100μmol/L的锌则使PC12细胞突起完全消失,存活率低于30%。结论:高浓度锌会导致细胞生长异常,甚至造成凋亡和坏死,且浓度越高这种作用会越明显。
2.TPEN对染锌的PC12细胞生长状况的影响:在培养的PC12细胞外液中分别加入不同浓度的锌离子,6小时后再分别加入等量的TPEN,24小时后观测其对细胞生长状态的影响。结果:加入TPEN后,80μmol/L和100μmol/L加锌组细胞的生长状况有显著改善;而对于40和60μmol/L加锌组的改变却不明显;对于低浓度的锌处理组(20μmol/L)反而使其细胞存活率有所下降。结论:加入锌离子螯合剂TPEN会对高浓度锌离子引起的细胞损伤状况有所缓解和改善。
3.不同浓度锌离子对培养的PC12细胞钾通道电流的影响:在培养的PC12细胞外液中分别加入不同浓度的锌离子,6小时后加入TPEN,24小时后观测锌和TPEN对细胞钾通道电流的影响。结果:1)40μmol/L的锌离子和60μmol/L的锌离子均会使外向延迟整流型钾电流密度增大,尤其是加入60μmol/L的锌离子后,在激活电压+80mV时的电流密度显著性增大。在含有40μmol/L的锌离子和60μmol/L的锌离子的细胞外液中加入TPEN后,钾通道电流密度明显下降。2)80μmol/L的锌离子会使外向延迟整流型钾电流密度减小,瞬时外向钾电流增大,加入锌离子螯合剂TPEN后,外向延迟整流型钾电流增大,瞬时外向钾电流基本无变化。结论:1)锌离子对电压依赖性钾通道的影响可能主要是通过延迟整流型钾通道来实现的;2)过量锌会影响外向延迟整流型钾通道电流的变化,不管是增加(40μmol/L和60μmol/L)还是减小(80μmol/L),都会造成钾离子动态平衡紊乱,影响细胞生存环境,扰乱神经细胞的电生理功能,不利于细胞生存,进而造成细胞死亡;3)锌离子螯合剂TPEN可在一定程度上缓解锌对外向延迟整流型钾离子通道造成的影响,起到一定的保护作用。
4.不同浓度锌离子对培养的大脑皮层神经元钾通道电流的影响:在培养的大脑皮层神经元外液中分别加入不同浓度的锌离子,6小时后加入等量TPEN,24小时后观测锌和TPEN对细胞钾通道电流的影响。结果:1)60μmol/L的锌离子和80μmol/L的锌离子均会使外向延迟整流型钾电流密度减小,尤其是加入80μmol/L的锌离子后,在激活电压+80mV时的电流密度显著性减小。2)在含有60μ,mol/L的锌离子和80μmol/L的锌离子的细胞外液中加入锌离子螯合剂TPEN后,钾通道电流密度上升。结论:1)过量锌(60μmol/L和80μmol/L)会减小钾离子通道电流,造成钾离子动态平衡紊乱,影响细胞生存环境,扰乱神经细胞的电生理功能,不利于细胞生存,进而造成细胞死亡。2)TPEN可通过螯合锌离子,缓解锌离子对钾通道的影响,进而起到一定的保护作用。