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目的：探讨瑞香素对CIA大鼠滑膜细胞促凋亡基因去甲基化作用及分子机制,进一步探索瑞香素治疗RA的可能机制,为瑞香素的药用开发和RA的治疗思路提供理论与实验依据。方法：1.培养CIA大鼠滑膜细胞；2.MTT法检测不同浓度瑞香素及5-aza-Dc对CIA大鼠滑膜细胞作用不同时间后对其增殖的影响；3.瑞香素对CIA大鼠滑膜细胞促凋亡基因去甲基化作用及分子机制：实验分组：①CIA大鼠滑膜细胞未处理组(对照组)；②阳性去甲基化试剂5-aza-Dc(20gM)处理组(5-aza-Dc组)；③瑞香素(40μg/mL)处理组(瑞香素组)；④瑞香素(40μg/mL)联合5-aza-Dc (20μM)处理组(联合组)。CIA大鼠滑膜细胞按上述实验分组,经常规培养72h后收集细胞,检测如下指标：(1)甲基化特异性PCR (methylationspecific PCR, MSP)检测促凋亡基因DR3、PDCD5、 FasL及p53甲基化状态；(2)实时荧光定量RT-PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)检测CIA大鼠滑膜细胞促凋亡基因DR3、PDCD5、FasL、p53及甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达；(3)流式细胞术检测促凋亡基因DR3、PDCD5、FasL及p53蛋白表达；(4)PI染色荧光显微镜观察滑膜细胞凋亡情况；(5)Annexin V/PI双染流式法检测滑膜细胞的凋亡率；(6)扫描和透射电镜法观察CIA大鼠滑膜细胞超微结构的改变。结果：1.①瑞香素浓度(μg/mL)为40、20、10、5、2.5、1.25时,分别作用CIA大鼠关节滑膜细胞72h、60h、48h、36h后,抑制率(%)分别为：82.80±0.85、80.20±1.41、59.70±1.13、49.35+1.34;57.50±1.27、53.15+3.18、42.75±3.89、34.00±5.37；43.75+4.74、37.15+4.45、35.05+3.32、29.55±1.63；40.50±3.82、35.90+5.09、33.90±4.95、28.70±0.34;37.40±4.53、34.25±5.73、27.85±1.48、23.15±3.18；33.25±3.46、26.50±1.98、25.65±0.42、19.50±1.13；②5-aza-Dc浓度(μM)为20、10、5、2.5、1.25时,分别作用于CIA大鼠滑膜细胞60h、48h、36h后,抑制率(%)分别为：84.30±1.56、82.90±3.39、72.10±1.84、32.35±2.62；57.35±4.31、46.15±3.89、34.15士3.18、25.75±4.17;53.65±1.20、45.40±3.68、23.65±0.70、20.25±0.07；49.30±1.27、39.90±1.27、17.35±1.48、13.65±1.20;30.95±2.19、24.41±2.68、13.23±0.53、9.19±1.17。2.MSP结果显示CIA大鼠滑膜细胞对照组中促凋亡基因DR3、PDCD5、FasL及p53甲基化引物和非甲基化引物均扩增出特异性条带。基因DR3、PDCD5、FasL和p53经瑞香素和5-aza-Dc处理后甲基化扩增条带亮度均有所降低,相应的非甲基化扩增条带亮度均有所增强。联合组可见促凋亡基因DR3、FasL、PDCD5及p53甲基化扩增产物条带较CIA大鼠滑膜细胞对照组和瑞香素、5-aza-Dc单独处理组亮度均降低,相应的非甲基化条带亮度增强；其中PDCD5甲基化引物不能扩增出甲基化特异性条带,而非甲基化引物可以扩增出特异性条带,呈现完全非甲基化状态。3. RT-PCR结果显示瑞香素组、5-aza-Dc组及联合组DR3、PDCD5、FasL、 p53mRNA表达水平明显高于对照组(P<0.05)：瑞香素、5-aza-Dc组及联合组甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达水平明显低于对照组(P如.05)。瑞香素组中促凋亡基因中除FasL外,DR3、PDCD5和p53mRNA表达水平均明显高于5-aza-Dc组；甲基化转移酶中除DNMT1外,DNMT3a和DNMT3b mRNA表达水平均明显低于5-aza-Dc组(P>0.05)。联合组中DR3、PDCD5、FasL和p53mRNA表达水平明显高于瑞香素组和5-aza-Dc单独处理组；甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达水平均显著低于瑞香素组和5-aza-Dc组(P<0.05)。4.流式细胞术结果显示瑞香素、5-aza-Dc组和联合组CIA大鼠滑膜细胞促凋亡蛋白DR3、PDCD5、FasL和p53阳性细胞百分率均显著高于对照组(P<0.05)；瑞香素组除FasL外,DR3、PDCD5和p53阳性细胞百分率均显著高于5-aza-Dc组(P<0.05)；联合组促凋亡蛋白DR3、PDCD5、FasL和p53阳性细胞百分率均显著高于瑞香素组和5-aza-Dc组(P<0.05)。5.PI染色后荧光显微镜下观察到：CIA大鼠滑膜细胞对照组细胞呈极少量的强红色荧光和微弱红色荧光；5-aza-Dc组滑膜细胞微弱红色和较强红色荧光较对照组增加；瑞香素组滑膜细胞微弱和较强红色荧光均较前两组有所增加；联合组滑膜细胞则大部分呈微弱和较强红色荧光。6. AnnexinV/PI双染流式法显示瑞香素组、5-aza-Dc和联合组CIA大鼠滑膜细胞早期凋亡和晚期凋亡率均显著高于CIA大鼠对照组(P<0.05)；联合组滑膜细胞凋亡率显著高于瑞香素组和5-aza-Dc组(P<0.05)。7.扫描电镜观察对照组CIA大鼠滑膜细胞可见细胞呈圆形或椭圆形,表面有丰富细密的微绒毛状突起;5-aza-Dc组可见细胞稍有形变,表面微绒毛减少；而瑞香素组较对照组变形严重,外观呈不规则状,细胞表面微绒毛状突起消失,主要变现为小泡状和指状突起；联合组滑膜细胞极度变形,细胞表面变得极为光滑,细胞表面局部已严重破裂。8.透射电镜显示对照组CIA大鼠滑膜细胞可见细胞表面绒毛、核膜结构清晰,核浆比大,核异型性明显,核仁清晰,胞浆内细胞器发育良好；5-aza-Dc组表现为细胞体积缩小,形态不规则,表面微绒毛消失,双层核膜清晰,核固缩,染色质边聚,胞质内有少量粗面内质网、溶酶体,线粒体肿胀并发生空泡变性,游离核糖体发达,呈凋亡改变；瑞香素组较5-aza-Dc组染色质发生浓聚,凋亡进一步发展；联合组滑膜细胞明显可见核膜消失,凋亡小体形成。结论：本实验属于原创性研究,首次探讨了金边瑞香活性成份瑞香素对CIA大鼠滑膜细胞促凋亡基因去甲基化作用及分子机制。1.瑞香素在1.25μg/mL-40μg/mL范围内对CIA大鼠滑膜细胞生长均有不同程度的抑制作用,且呈现良好的剂量依赖性。2.瑞香素对CIA大鼠滑膜细胞促凋亡基因DR3、PDCD5、FasL及p53启动子区具有一定的去甲基化作用。3.瑞香素可协同5-aza-Dc使CIA大鼠滑膜细胞促凋亡基因DR3、PDCD5、 FasL及p53启动子去甲基化,表达增加,促进滑膜细胞凋亡。4.瑞香素促进CIA大鼠滑膜细胞凋亡的分子机制之一为降低DNA甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达,使促凋亡基因DR3、PDCD5、 FasL及p53启动子部分去甲基化,重新表达,最终使CIA大鼠滑膜细胞呈凋亡改变。上述实验结果可望为瑞香素的药用开发和RA的治疗思路提供理论与实验依据。