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研究目的:青藤碱的抗炎作用机制已有一些研究,但其作用于免疫细胞上的确切靶点尚不清楚。本实验室前期研究表明,体外实验中巨噬细胞RAW264.7表面的α7nAChR是青藤碱发挥抗炎免疫作用的关键靶点,而青藤碱体内的抗炎作用是否依赖于α7nAChR尚未明确。本研究首先考察青藤碱在内毒素血症模型小鼠中是否可以通过α7nAChR发挥抗炎作用,再进一步研究青藤碱对小鼠体内不同组织器官α7nAChR表达的影响。从以上方面来阐明青藤碱通过作用于α7nAChR发挥抗炎作用的免疫药理学机制。研究方法:1.青藤碱体内抗炎作用与α7nAChR的关系实验采用LPS腹腔注射建立小鼠内毒素血症模型,腹腔注射给药,观察青藤碱的抗炎作用与靶向α7nAChR的关系。首先确定LPS的致死剂量,并观察烟碱、青藤碱对小鼠死亡率的影响。然后采用LPS(15mg/kg)腹腔注射建立小鼠内毒素血症模型,ELISA检测小鼠血清TNF-α、IL-6水平随时间的变化,确定其峰值时间点。采用烟碱做为靶向α7nAChR阳性对照药,小檗碱作为靶向α7nAChR阴性对照药,确定不同剂量青藤碱、烟碱、小檗碱对TNF-α抗炎剂量。再观察nAChR特异性拮抗剂美加明对青藤碱抗炎作用的影响,ELISA检测血清中TNF-α、IL-6分泌量,研究nAChR特异性的拮抗剂是否能抑制青藤碱的抗炎作用。最后观察α7nAChR特异性的拮抗剂α-银环蛇毒素对青藤碱抗炎作用的影响,ELISA检测血清中TNF-α IL-6分泌量,研究α7nAChR特异性的拮抗剂是否能抑制青藤碱的抗炎作用。2.青藤碱对内毒素血症小鼠α7nAChR表达的影响实验选用BALB/c小鼠,腹腔注射LPS(15mg/kg)建立内毒素血症模型,注射LPS前30min腹腔注射青藤碱、烟碱、小檗碱。注射LPS 3h时,提取小鼠腹腔巨噬细胞;注射LPS 6h时,脱颈椎处死小鼠,摘除小鼠肝脏、脾脏、胸腺、脑、肠系膜上淋巴结,4%多聚甲醛固定或-70℃冻存。其中,免疫荧光检测腹腔巨噬细胞α7nAChR表达,免疫组化检测小鼠肝脏、脾脏、胸腺α7nAChR表达,RT-PCR检测小鼠肝脏、脾脏、胸腺、脑、肠系膜上淋巴结α7nAChR表达,WesrernBlot检测小鼠脑、肠系膜上淋巴结α7nAChR表达。以上实验用于研究青藤碱对α7nAChR表达的影响。研究结果:1.青藤碱体内抗炎作用与α7nAChR的关系实验结果显示:40mg/kg的LPS在72h内,对小鼠的致死率高达66.7%,提前30min注射青藤碱80mg/kg、烟碱2mg/kg分别降低内毒素血症小鼠死亡率至0%、22.2%。15mg/kg的LPS能成功建立内毒素血症小鼠模型,且小鼠血清TNF-α、IL-6分别在1h、3h达到峰值。在20-160mg/kg的剂量范围内,青藤碱具有抗炎作用,在40-160mg/kg的剂量范围内,青藤碱抗炎作用具有剂量依赖性。烟碱2mg/kg、小檗碱20mg/kg均能有效抑制LPS(15mg/kg)诱导的小鼠血清TNF-α增加。美加明是nAChR特异的拮抗剂,2mg/kg的美加明能有效拮抗青藤碱和烟碱的抗炎作用。α-银环蛇毒素是α7nAChR特异的拮抗剂,8μpg/kg的α-银环蛇毒素能有效拮抗青藤碱和烟碱的抗炎作用。2.青藤碱对内毒素血症小鼠α7nAChR表达的影响小鼠腹腔注射LPS(15mg/kg)建立内毒素血症模型,并于造模前30min腹腔注射给药。结果显示,内毒素血症模型小鼠的腹腔巨噬细胞、肝脏、脾脏、胸腺、肠系膜上淋巴结、脑中α7nAChR表达均明显升高,青藤碱均下调其α7nAChR表达,小檗碱对各组织部位α7nAChR表达无明显影响。而烟碱下调腹腔巨噬细胞、肝脏、脑中α7nAChR表达,但对脾脏、胸腺、肠系膜上淋巴结α7nAChR表达表现上调作用。结论:1.青藤碱在内毒素血症模型小鼠体内的抗炎作用依赖于α7nAChR,α7nAChR是青藤碱在体内发挥抗炎作用的重要靶点。2.青藤碱对内毒素血症模型小鼠不同组织器官的α7nAChR表达均起到抑制作用。