聚乳酸(PLA)是以乳酸为主要原料聚合得到的，是众所周知的生物可降解和生物相容性塑料。而生产聚乳酸通常需要高光学纯度的乳酸单体，由于可以通过混合L-或D-乳酸进行聚合提高聚乳酸的机械性能，高光学纯度D-乳酸的合成正在吸引科学界和工业界越来越多的注意。D-乳酸生产主要采用微生物发酵法，传统的乳酸发酵过程需要使用碳酸钙作为中和剂以维持所需的pH值，在后期提纯过程中会产生大量不溶性的废弃物硫酸钙，造成严重的环境污染。为了克服这种环境问题，人们正积极探索使用氢氧化钠作为中和剂发酵生产有机酸，然而此工艺的高钠离子浓度使现有发酵菌株都难以达到理想的效果。嗜碱微生物由于具有很好的钠离子耐受能力，具有巨大的应用潜力。此外，盐碱条件可以降低乳酸发酵过程中的污染机率，可以采用无需对发酵设备和发酵培养基进行灭菌的策略，这种开放式发酵由于无需经过高压高温灭菌，因此可以避免在此过程中营养元素的降解，并且开放式发酵还具有发酵过程步骤少、对设备仪器需求简单、运行费用低以及避免通过美拉德反应而造成营养流失等优点。目前，嗜碱微生物基于氢氧化钠作为中和剂工艺，使用低价氮源发酵生产D-乳酸尚没有研究报道。　　嗜碱菌是指最适生长pH值在9以上，通常pH值范围在10-12之间。由于嗜碱菌生存于极端环境中，具有一些与普通细菌不同的特殊生理机制。其中一个关键机制是，在极端碱性环境中，嗜碱菌需要维持细胞内pH偏中性环境。研究发现，嗜碱菌维持胞内pH稳定主要是依靠细胞膜的屏障功能来实现的。例如，膜蛋白Na+/H+泵能把胞外氢离子泵入胞内，同时将胞内钠离子排出胞外，从而维持胞内pH值;细胞膜上的F1F0ATPase不但可以合成ATP为Na+/H+泵提供能量，而且转运呼吸链传递的氢离子到胞内，从而防止胞内氢离子的流失。　　细菌的耐盐性对发酵工业具有重要意义。大多数微生物在面对高盐环境压力时，常通过在胞内积累相容性溶质来维持细胞内外渗透压平衡。同时，胞内多余的Na+通过特定的机制排到胞外，降低胞内的盐浓度，使细胞能够保持正常的形态、结构和生理功能。相容性溶质一般是指与细胞内体系相容并且不影响其它生物大分子功能的小分子物质。这类物质包括甘氨酸甜菜碱、脯氨酸、海藻糖和四氢嘧啶等，它们在胞内的积累可以通过自身的生物合成及从外部环境主动吸收来实现。　　嗜碱芽孢杆菌N16-5（Bacillus sp.N16-5）是本实验室分离于内蒙古乌杜淖碱湖的一株兼性厌氧嗜碱菌。该菌株在pH范围7.5-11.0，NaCl浓度范围1-15.0％内生长良好。同时，它具有广泛的底物谱，可以吸收利用各种类型的糖，如戊糖、己糖和多糖。对于该菌株的碳源利用途径及基因调控机制，已经通过全基因组表达芯片的方法进行了全局的分析研究。此外，芽孢杆菌N16-5盐胁迫适应机制也得到了系统而全面的研究。该菌株盐适应机制包括K+的主动吸收、Na+的流出、SigB的调控、分子伴侣应激反应以及相容性溶质的积累等。另外，芽孢杆菌N16-5转化方法以及用于基因敲除的遗传操作系统已经被成功建立。因此，基于其自身生长特点、对各种碳源的利用能力以及成熟的研究背景和有效的遗传操作系统，芽孢杆菌N16-5有潜力被开发成用于工业生产的嗜盐碱工业菌株。　　本研究采用多种策略，并结合芽孢杆菌N16-5自身特点来构建生产高光学纯度D-乳酸的工程菌。首先，为使芽孢杆菌N16-5转变成高光学纯度D-乳酸的生产菌株，我们把它本身的L-乳酸脱氢酶基因（L-1dh）进行敲除，然后通过构建表达载体来表达来源于德氏乳杆菌的D-乳酸脱氢酶。在构建表达载体过程中，对来自芽孢杆菌N16-5的不同启动子（P3，PLDH，PyxiE在和PGroE）强度进行了测试，结果发现，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶在启动子PLDH的控制下，其活性最高。因此，我们选择了PLDH作为启动子表达元件来表达来源于德氏乳杆菌的D-1dh基因，首先是把PLDH与D-1dh通过PCR融合在一起，再连接到穿梭载体pMK4上，最后把重组载体转化芽孢杆菌N16-5，从而得到Bacillus.Δ1dh-pDlac菌株。经过测试发现，该重组菌株只产生D-乳酸，并且Δ1dh-pDlac菌株的生长和乳酸的积累类似于野生型(WT)。这意味着，合成D-乳酸取代L-乳酸并没有对细胞代谢通量平衡产生影响。更重要的是，Δ1dh-pDlac菌株能合成并积累高水平的D-乳酸，其产量比野生菌株积累的的L-乳酸高，这可能是由于，与野生型菌株的L-1dh基因相比，外源D-1dh基因的表达水平更高。　　与其它嗜碱菌一样，芽孢杆菌N16-5在高盐环境下生长时，也能合成大量的胞外多糖(EPS)。在发酵实验过程，我们发现过多的胞外多糖能增加发酵液的粘性，不利于发酵下游的处理。通过文献分析后，发现epsD基因是负责EPS生物合成的关键基因。因此，我们尝试敲除芽孢杆菌N16-5的epsD基因来抑制胞外多糖的合成。所得菌株被命名为Bacillus.N16-5ΔldhΔepsD。结果表明，虽然，Δ1dhΔepsD菌株仍产生了一些EPS，但是epsD基因的缺失足以减少发酵后培养基的粘度。无论该菌株使用Horikoshi培养基或者是基于花生粕的培养基，发酵液都可以通过一步离心而得到培养上清液。　　然后，将构建的重组菌株通过以下策略来进行D-乳酸的发酵:　　1)很多文献已经报道，花生饼粉可以作为一种很好的氮源来用于发酵生产，因此实验首先尝试了以花生饼粉为氮源，以葡萄糖为碳源来获取高产量的乳酸。　　2)使用开放式工业发酵技术，从而降低了对设备的需求，以及减少能量消耗和劳动成本。　　3)基于氢氧化钠作为中和剂的处理方法，避免传统的中和剂使用过程中会形成大量的不溶性硫酸钙，影响发酵后期的处理及造成环境污染。　　对以上这些策略进行了补料分批发酵，并获取了高收率、光学纯度高的、以及高滴度的D-乳酸。　　通过发酵条件优化，发现使用花生饼粉作为氮源能获得最高的乳酸产量，在30 g/L的花生粉浓度条件下，发酵后，乳酸产率可以达到近乎理想的100％。虽然，使用果糖作为碳源获得的乳酸产量最高，但是，由于葡萄糖作为碳源比果糖更便宜，这使葡萄糖在发酵生产乳酸过程中更具有竞争力。本文还研究分析了不同盐浓度对乳酸产量的影响，结果显示，加入乙酸钠可以有效提高乳酸的产量，乙酸钠初始浓度为2 g/L时，发酵获得的乳酸产量最高。在发酵生产乳酸过程中，发酵的最佳初始葡萄糖浓度为80 g/L，最佳pH值为9.0，最佳的发酵生产温度37℃。在这些条件下，通过发酵能获得最高的乳酸生产速率（生产力）和产率。　　基于上述优化条件，使用基于花生粉的培养基在1L发酵罐中进行分批补料发酵。首先，分批补料发酵在无菌条件下进行。在发酵过程中，前12小时内，葡萄糖略有消耗和D-乳酸的产量略有增加。当停止供氧后，D-乳酸的产量迅速增加。在发酵的第16 h的阶段，具有最高产率，可以到达约3.02 g/L/h。最终D-乳酸浓度达到142.05 g/L，转化率为94.25％。在开放式发酵过程中，发酵条件与上述无菌的发酵相同。在开放式条件下，D-乳酸浓度达到143.99 g/L，转化率为96.09％，略高于同条件下的无菌发酵过程，同样，与无菌发酵过程相比，开放式发酵的产率可以达到1.674 g/L/h，其中在发酵的第16 h的阶段，具有高达3.04 g/L/h的产率。两种条件下获得的D-乳酸的光学纯度约99.85％。　　此外，为了阐释嗜碱菌N165在盐碱条件下高产D-乳酸的生理机制，我们对嗜碱芽孢杆菌N16-5与中性菌芽孢乳杆菌Sporolactobacillus laevolacticusDSM442的发酵特点进行了对比分析，我们主要检测了氯化钠和乳酸钠的浓度变化以及在发酵过程相容性溶质的变化，结果发现嗜碱芽孢杆菌N16-5产生相容性溶质如甜菜碱、四氢嘧啶和海藻糖的水平较高，而中性芽孢乳杆菌S.laevolacticus DSM442产生甜菜碱和海藻糖的量比嗜碱芽孢杆菌N16-5低约10倍。这个结果说明，嗜碱菌产生相容性溶质的能力提高了菌株对高钠离子环境的耐受性，使其成为基于氢氧化钠作为中和剂发酵生产乳酸的潜力菌株。　　综上所述，本工作基于嗜碱菌的特殊生理机制，研发了一种生产高光学纯D-乳酸的新工艺。