【摘 要】
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枳雀（Citrus wilsonii Tanaka）是陕南地区特有的柑橘药用资源,对缓解咳嗽和积食伤酒具有较好的疗效。本实验室前期研究发现枳雀类黄酮粗提物（ZQE）在小鼠巨噬细胞（RAW264.7）和小鼠原代骨髓来源树突状细胞（BMDC）模型中,能够显著抑制脂多糖（LPS）诱导的炎症反应。经高效液相色谱检测,枳雀黄酮粗提物中主要成分为柚皮苷。目前,己有柚皮苷抗炎功能的相关报道,但柚皮苷的靶点蛋白及
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枳雀（Citrus wilsonii Tanaka）是陕南地区特有的柑橘药用资源,对缓解咳嗽和积食伤酒具有较好的疗效。本实验室前期研究发现枳雀类黄酮粗提物（ZQE）在小鼠巨噬细胞（RAW264.7）和小鼠原代骨髓来源树突状细胞（BMDC）模型中,能够显著抑制脂多糖（LPS）诱导的炎症反应。经高效液相色谱检测,枳雀黄酮粗提物中主要成分为柚皮苷。目前,己有柚皮苷抗炎功能的相关报道,但柚皮苷的靶点蛋白及抗炎机制。因此,本文在实验室前期工作的基础上,利用枳雀果实提取并合成生物素标记的柚皮苷,来研究柚皮苷抗炎功能的靶点蛋白并初步探究其抗炎机理。主要研究结果如下:（1）生物素标记柚皮苷合成。利用6个发育时期的枳雀冻干粉,分别提取出枳雀类黄酮粗提物,检测了不同发育时期枳雀中柚皮苷的含量。选择柚皮苷含量最高的枳雀粗提物,通过半制备型液相色谱分离、纯化柚皮苷,得到柚皮苷纯度为98.90%。选择柚皮苷结构中的糖羟基作为反应位点,通过酯化、缩醛化和Sonagarshia偶联3步反应合成了生物素标记的柚皮苷（Bio-Nar）。（2）合成的Bio-Nar抗炎活性验证。试验结果表明,在RAW264.7巨噬细胞模型中,Bio-Nar能够显著的降低LPS诱导并释放到细胞外的一氧化氮（NO）的水平。在细胞内,Bio-Nar能够显著的抑制经LPS诱导产生的相关炎症因子的mRNA水平表达量,包括环氧酶-2（COX-2）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）。这些结果表明生物素标记后的柚皮苷,其抗炎活性位点未被掩盖,仍具有抗炎活性。（3）柚皮苷靶蛋白筛选。利用免疫沉淀的方法,通过链霉亲和素磁珠,从RAW 264.7巨噬细胞细胞裂解产物中捕获靶标蛋白。经SDS-PAGE和银染,通过与利用生物素捕获的靶标蛋白进行比对,结果发现了一条明显的差异条带。对两次试验获得的差异条带分别进行质谱鉴定,两次结果共有的蛋白有4种,分别是60kDa的热休克蛋白（HSP60）、组蛋白H2B、丙酰辅酶A羧化酶以及肌动蛋白。通过查阅相关文献发现,HSP60与组蛋白H2B与炎症的关系较密切。进一步的分子对接试验结果表明柚皮苷分别与HSP60和组蛋白H2B进行对接所需的能量很低,分别为-5.85 kcal/mol和-6.92kcal/mol。这说明HSP60和组蛋白H2B为柚皮苷发挥抗炎功能的潜在靶标蛋白。（4）HSP60作为柚皮苷抗炎靶点的验证。通过柚皮苷与生物素标记的柚皮苷竞争结合的实验,验证了柚皮苷能够结合HSP60。LPS与HSP60之间的协同作用也进一步的在小鼠巨噬细胞中得到验证。试验结果表明,柚皮苷靶向HSP60后,可能抑制了 LPS与HSP60之间协同增强免疫应答的功能,从而抑制了 LPS诱导产生的炎症反应。本研究表明枳雀中柚皮苷含量在花后70天较高,随着果发育其含量逐渐降低。在小鼠巨噬细胞模型中,纯化及标记后的枳雀柚皮苷经仍具有教好的抗炎活性,有较大的潜力开发成抗炎药物。利用生物素标记和链霉亲和素磁珠筛选到了柚皮苷筛潜在靶蛋白,进一步通过竞争结合试验验证了柚皮苷能够结合靶蛋白HSP60,并推测了柚皮苷靶向HSP60的抗炎机制,这为后续深入研究柚皮苷抗炎药物及柑橘药用资源的开发与利用奠定了基础。
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