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研究背景：
阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)是以老年斑(senile plaque,SP)、神经纤维缠结(neuofibrillary tangle,NFD和区域性神经元的丢失为主要病理特征的神经退行性疾病。其中SP的主要成分是β-淀粉样肽(β-amyloid,Aβ),它是由淀粉前体蛋白(amyloid protein precursor,APP)在β裂解酶(β-site APP cleavageenzyme,BACE1)和γ裂解酶的协同作用下裂解产生。Aβ可诱导神经元突触结构损坏、神经元死亡、tau蛋白过度磷酸化以及体内的炎性反应等,导致AD发病。散发性AD的发病机制十分复杂,氧化应激是导致AD发病的一个重要原因。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)链是真核生物信号传递网络中的重要途径之一,其中JNK和p38 MAPK信号转导通路在炎症、应激反应中发挥重要的作用。尸检发现AD患者大脑中p38MAPK和JNK信号通路均被激活,而且AD的动物模型如Tg2576转基因小鼠,脑组织中也发现p38MAPK和JNK信号通路的激活。近年来大量研究发现,AD患者APP启动子区域的甲基化水平下降,AD的动物细胞模型研究中也发现APP、BACE1和PS1基因的表达受其甲基化水平的调控,最终都导致了Aβ生成增多。因此,表观遗传学如DNA甲基化、组蛋白乙酰化等在AD发病过程中发挥了重要的作用。
研究目的：
本实验通过观察氧化应激相关信号通路的激活对Aβ生成、DNA启动子甲基化水平和组蛋白乙酰化水平的影响,探讨氧化应激在AD早期发病表观遗传学机制中的作用。
材料和方法：
培养人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞,采用茴香霉素(anisomycin,2×10-3mg/L)分别处理细胞1和72 h。
1、蛋白印迹法(western blot)检测phospho-p38MAPK和phospho-JNK、APP,BACE1和PS1蛋白、DNMT1和DNMT3b、KAT3A/CBP和HDAC3以及C83和C99的表达；
2、实时定量PCR(Q-PCR)检测APP,BACE1和PS1 mRNA的表达；
3、MassARRAY(R)EpiTYPERTM DNA甲基化定量分析技术检测APP、BACE1和PS1启动子甲基化水平:
4、EpiQuikTM Global Assay Kit检测组蛋白H3和H4乙酰化水平；
5、ELISA法检测Aβ生成的变化。
研究结果：
1、p38MAPK和JNK信号通路的激活可使细胞内Aβ生成增多:与对照组相比,SH-SY5Y细胞经茴香霉素处理72h后细胞内Aβ1-40含量增加了约20.0％；APP、PS1和BACE1 mRNA及蛋白表达均增加；C83含量下降,C99含量增加；
2、APP、BACE1和PS1基因启动子甲基化水平下降:SH-SY5Y细胞经茴香霉素处理72h后,与对照组相比,APP、BACE1、PS1基因启动子甲基化水平明显降低,分别下降了约27.71％、20.68％和19.29％。
3、DNA甲基转移酶表达下降:与对照组相比,SH-SY5Y细胞经茴香霉素处理细胞72h后,DNMT1、DNMT3a的表达均减少,分别约为16.8％和19.2％。
4、组蛋白乙酰化水平及相关酶的表达改变:SH-SY5Y细胞经茴香霉素处理72h后,与对照组相比,H3乙酰化水平明显提高(约3.2倍),H4乙酰化水平无变化；KAT3A/CBP表达明显增多,HDAC3表达明显减少。
研究结论：
氧化应激相关信号通路的激活可通过调控DNA甲基化和组蛋白乙酰化等表观遗传学机制,诱导Aβ生成增加,氧化应激在AD表观遗传学发病机制中发挥一定的作用。