背景结肠癌是全世界范围内最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在所有肿瘤中分别占第二位和第三位,给患者、家庭和社会带来了沉重的负担。目前,结肠癌的临床治疗主要是以手术治疗为中心,联合放化疗、免疫治疗、分子靶向药物治疗等多种治疗方案的综合治疗。这些治疗方法虽然能够延长患者的生存时间,改善患者的生活质量,但是大多数结肠癌患者在确诊时肿瘤即已发展为中晚期,甚至已经发生远处组织脏器转移,导致患者的预后极差。肿瘤血管生成作为肿瘤微环境的重要组成部分,对肿瘤的生长、免疫细胞的浸润以及肿瘤细胞向远处组织脏器的转移具有重要的作用,多项研究证明抗血管生成治疗是一种非常有前景的肿瘤治疗策略。因此,探索结肠癌的发生、发展以及血管生成的分子作用机制,为结肠癌的临床治疗提供合适的靶标和预后相关的生物标志物是目前结肠癌科学研究的主要方向。长非编码核糖核酸（lncRNA）,是指转录长度超过200 nt的非编码RNA。目前,研究证明lncRNA能够通过表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等多个层面调节基因的表达,参与细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学过程。DNA甲基化是一种表观遗传修饰,其可以抑制基因的表达,对维持染色体的结构、X染色体的失活、基因印记和肿瘤的发生发展起着重要的作用。LINC01116位于2q31.1染色体,全长1058bp,研究发现在多种恶性肿瘤中LINC01116均表达上调,具有促进肿瘤细胞增殖、迁移和血管生成的作用,如上皮性卵巢癌、膀胱癌、脑胶质瘤、骨肉瘤等。在作用机制方面,LINC01116被报道能够通过竞争性结合miR-520a-3p,上调骨肉瘤细胞中IL6R的表达,从而激活Jak-stat信号通路,促进骨肉瘤细胞的增殖和迁移。在脑胶质瘤细胞中,LINC01116可招募转录因子DDX5至IL-1β的启动子区域从而促进其表达,诱导肿瘤细胞的增殖。然而,关于LINC01116在结肠癌中的表达及其生物学功能目前却鲜有报道,需要更多的研究来探索LINC01116在结肠癌中的调控机制。目的本研究拟通过检测LINC01116在结肠癌组织中的表达、分析其预后相关性,并探究其对结肠癌细胞生物学功能的影响。然后通过生物学信息预测并分析与LINC01116作用相关的分子,探究其相互作用机制。最后通过体内实验进一步证实LINC01116对结肠癌细胞生物学功能的影响。第一部分 LINC01116在结肠癌组织中的表达、临床意义及在结肠癌细胞中的功能方法:1.RT-qPCR检测80例结肠癌组织及癌旁正常组织中LINC01116的表达,分析LINC01116的表达与患者临床病理情况和术后生存时间的关系。2.RT-qPCR检测LINC01116在结肠癌细胞系和人正常结肠上皮细胞中的表达。3.在 SW480 和 HCT116 细胞中分别转染 pcDNA3.1-LINC01116、sh-LINC01116后,RT-qPCR检测LINC01116的表达,CCK-8和平板克隆形成实验检测细胞增殖情况,细胞划痕实验检测与转染SW480或HCT116细胞后共培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）迁移能力,小管形成实验检测HUVEC血管生成情况。结果:1.RT-qPCR检测结果显示:LINC01116在结肠癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织（P＜0.001）,并且结肠癌组织中LINC01116的表达水平与肿瘤的组织分化程度和直径大小显著相关（P＜0.05）。Kaplan-Meier分析结果表明:LINC01116高表达组的结肠癌患者相对于LINC01116低表达组的结肠癌患者5年生存率更低,两者具有显著性差异（P＜0.05）。2.RT-qPCR检测结果显示:LINC01116在结肠癌细胞系中的表达显著高于人正常结肠上皮细胞（P＜0.05）。3.RT-qPCR 检测结果显示:pcDNA3.1-LINC01116 组相比 pcDNA3.1 组,LINC01116 表达水平较高（P＜0.01）,sh-LINC0 1116 组相比 sh-NC 组 LINC01116表达水平较低（P＜0.01）,而pcDNA3.1组和sh-NC组LINC01116的表达水平与空白组无显著差异。CCK-8和平板克隆形成实验检测结果显示:pcDNA3.1-LINC01116组相比pcDNA3.1组细胞增殖活性和克隆数升高（P＜0.05）,sh-LINC01116组相比sh-NC组细胞增殖活性和克隆数降低（P＜0.05）。划痕实验和小管形成实验结果显示:pcDNA3.1-LINC01116组共培养后的HUVEC细胞迁移率和形成的小管总长度显著大于pcDNA3.1组,sh-LINC01116组共培养后的HUVEC细胞迁移率和形成的小管总长度显著小于sh-NC组（P＜0.05）。小结:LINC01116在结肠癌肿瘤组织中高表达,与肿瘤的组织分化程度和直径大小显著相关,LINC01116高表达组的结肠癌患者相比LINC01116低表达组的结肠癌患者生存期显著降低。细胞实验表明LINC01116促进了结肠癌细胞的增殖和体外血管生成,这些结果表明LINC01116在结肠癌中发挥促肿瘤的作用并可作为一种潜在的预后标志物。第二部分 LINC01116通过EZH2/TPM1信号途径促进结肠癌细胞的增殖和血管生成方法:1.通过TCGA数据库分析TPM1在结肠癌组织中的表达情况。2.RT-qPCR与Western blot检测TPM1在结肠癌细胞系和人正常结肠上皮细胞中的表达。3.在 SW480 和 HCT116 细胞中分别转染 pcDNA3.1-LINC01116、sh-LINC01116 后,RT-qPCR 与 Western blot 检测 TPM1 的表达水平。在 SW480和HCT116细胞中转染sh-TPM1后,RT-qPCR和Western blot检测TPM1的表达水平。在 SW480 和 HCT116 细胞中分别转染 sh-LINC01116 和sh-LINC01116+sh-TPM1后,CCK-8和平板克隆形成实验检测细胞增殖情况,划痕实验检测与转染后SW480或HCT116细胞共培养的HUVEC迁移能力,小管形成实验检测HUVEC血管生成情况。4.利用 RNAInter（http://www.rnainter.org）预测与 LINC01116 相结合的蛋白EZH2,利用UCSC（http://genome.ucsc.edu）证实TPM1的潜在转录因子为EZH2。TCGA数据库显示EZH2在结肠癌组织中表达丰富,对TPM1有负调控作用。RT-qPCR和Western blot检测EZH2在结肠癌细胞系中的表达。RIP和RNA pulldown实验鉴定LINC01116与EZH2和H3K27me3的结合,ChIP实验鉴定EZH2与TPM1启动子的相互作用。5.在 SW480 和 HCT116 细胞中分别转染 pcDNA3.1-EZH2、sh-EZH2、sh-EZH2+sh-TPM1 后,RT-qPCR 与 Western blot 检测 EZH2 和 TPM1 的表达水平。CCK-8和平板克隆形成实验检测细胞增殖情况,划痕实验检测与转染后SW480或HCT116细胞共培养的HUVEC迁移能力,小管形成实验检测HUVEC血管生成情况。结果:1.TCGA数据库表明相比于正常组织,TPM1在结肠癌组织中的表达显著降低。2.RT-qPCR和Western blot法检测结果显示:TPM1在结肠癌细胞系中的表达相较于人正常结肠上皮细胞显著降低（P＜0.05）。3.在SW480和HCT116细胞中,过表达LINC01116后TPM1表达下调,敲低 LINC01116 后 TPM1 表达升高（P＜0.05）。相比于 sh-LINC01116 组,sh-LINC01116+sh-TPM1共转染组促进了细胞增殖和克隆形成（P＜0.05）。sh-LINC01116+sh-TPM1组共培养后的HUVEC细胞迁移率和形成的小管总长度显著大于 sh-LINC01116 组（P＜0.05）。4.生物信息学的分析显示LINC01116与EZH2具有很强的结合能力,并且EZH2是TPM1潜在的转录因子。TCGA数据库显示,EZH2在结肠癌组织中高表达,且与TPM1的表达负相关（P＜0.05）。RT-qPCR和Western blot结果显示:相比于人正常结肠上皮细胞,EZH2在结肠癌细胞系中的表达显著升高（P＜0.05）。RIP实验结果显示,EZH2抗体拉下的复合物中明显富集了LINC01116（P＜0.001）。同时,ChIP实验结果显示EZH2抗体拉下的复合物中也富集了 TPM1启动子（P＜0.001）,说明EZH2可结合到TPM1的启动子区域。RNA pulldown结果显示LINC01116与H3K27me3存在直接的相互作用（P＜0.05）。5.在 SW480 和 HCT116 细胞中分别转染 pcDNA3.1-EZH2、sh-EZH2、sh-EZH2+sh-TPM1 后,pcDNA3.1-EZH2 组相比 pcDNA3.1 组 EZH2 表达强烈,TPM1表达降低（P＜0.05）。sh-EZH2组相比sh-NC组,EZH2表达受抑制,TPM1表达升高（P＜0.05）。CCK-8和平板克隆形成实验显示:pcDNA3.1-EZH2组相比pcDNA3.1组细胞的增殖活性和克隆数升高（P＜0.05）。sh-EZH2组相比于sh-EZH2+sh-TPM1组细胞的增殖活性和克隆数降低（P＜0.05）。划痕实验和小管形成实验显示:pcDNA3.1-EZH2组相比pcDNA3.1组,HUVEC细胞的迁移率和形成的小管总长度升高（P＜0.05）。sh-EZH2组相比sh-EZH2+sh-TPM1组,HUVEC细胞的迁移率和形成的小管总长度降低（P＜0.05）。小结:TPM1在结肠癌组织和结肠癌细胞系中的表达显著下调而EZH2的表达则显著升高,LINC01116促进结肠癌细胞增殖和血管生成的机制是通过招募EZH2到TPM1的启动子区域促进TPM1的启动子甲基化,进而降低TPM1的表达。第三部分 LINC01116促进体内移植瘤的生长和血管生成方法:采用sh-LINC01116或sh-NC转染SW480细胞,然后将细胞注射到裸鼠右腋皮下构建裸鼠皮下移植瘤模型,实验结束时处死小鼠取出肿瘤,将肿瘤称重,RT-qPCR和Western blot分别检测肿瘤组织中LINC01116、EZH2和TPM1的表达,HE染色检测肿瘤组织病理情况,IHC检测肿瘤组织中CD31和Ki-67的表达,观察肿瘤生长和血管生成情况。结果:sh-LINC01116或sh-NC转染的SW480细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型2周后,肿瘤的成瘤率为100%。sh-LINC01116组移植瘤中LINC01116和EZH2的表达显著低于sh-NC组,而TPM1的表达则显著高于sh-NC组（P＜0.05）。sh-LINC01116组移植瘤体积显著小于sh-NC组（P＜0.05）。HE染色表明sh-LINC01116组移植瘤组织中肿瘤的细胞密度显著小于sh-NC组,并且肿瘤细胞坏死数明显增加。IHC的结果显示,sh-LINC01116组移植瘤组织中CD-31和Ki-67的表达显著低于sh-NC组。小结:LINC01116在小鼠体内可促进结肠癌肿瘤的生长和血管生成,并且抑制肿瘤细胞的凋亡,体内实验的结果显示LINC01116可提高EZH2的表达而降低TPM1的表达,与细胞水平的结果一致。结论:LINC01116在结肠癌组织中高表达并与患者的不良预后显著相关,提示LINC01116是一种潜在的结肠癌预后的分子标志物。LINC01116通过招募EZH2促进TPM1启动子甲基化,抑制TPM1基因的转录,促进结肠癌细胞的增殖和血管生成。体内实验同样验证了 LINC01116的“癌基因”功能。