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维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）是一种重要的人、兽及水生动物共患病原菌,其不但可以感染包括鱼类在内的水生动物,也可感染包括人在内的哺乳动物,在给水产养殖业造成巨大经济损失的同时也严重威胁着人类的健康。但目前仍然缺乏针对A.veronii病的有效防控措施,对A.veronii致病机理了解过少,是限制我们制定有效防控措施的重要因素。相关研究表明,细菌Hanks样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（也称类真核细胞样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）是一种重要的调控因子,影响病原菌的致病性。目前,绝大多数Hanks样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶发现于革兰氏阳性菌,仅少数于革兰氏阴性菌中被发现,且在不同细菌中的功能存在明显差异,而目前尚无关于A.veronii Hanks样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能研究的报道。因此,对其功能进行深入研究将有助于我们进一步了解A.veronii的致病机理。本研究对A.veronii TH0426株基因组中存在的两个Hanks样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Prk C和Yih E的功能进行了初步研究,首先构建了prkC和yih E基因缺失菌株,分析与其相关的生物学表型变化,初步明确了Prk C和Yih E的功能;并利用比较蛋白质组学分析A.veronii Hanks样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Prk C参与调控的相关代谢通路,分析Prk C的功能;进一步通过高通量磷酸化修饰定量蛋白质组学技术全面分析prkC缺失前后A.veronii蛋白质磷酸化修饰水平的变化,分析磷酸化差异表达蛋白生物学功能及其参与的相关代谢通路等,最后利用Pull-down-MS技术筛选与Prk C蛋白直接相互作用的靶蛋白,探究Prk C介导磷酸化修饰调控A.veronii相关表型变化的分子机制。主要研究结果如下:（1）成功构建A.veronii prkC和yih E基因缺失菌株,分析发现在对数生长期内缺失株△prkC的生长速度显著低于野生株,而缺失株△yih E的生长速度则与野生株TH0426基本一致,无明显变化,表明prkC基因的缺失影响了A.veronii的生长速度;黏附和侵袭能力检测结果显示,野生株TH0426对EPC细胞黏附和侵袭能力为6.73±0.5%,缺失株△prkC为2.63±0.4%,差异非常显著,而缺失株△yih E为3.76±0.2%,也存在显著差异,表明prkC和yih E基因的缺失均减弱了A.veronii对EPC的黏附和侵袭力,相比yih E,prkC的影响更明显;细胞毒性试验结果显示,在感染2h和3h后,野生株TH0426对EPC毒性分别是缺失株△prkC的6.54倍和5.29倍,差异极显著,是缺失株△yih E的2.94倍和1.64倍,差异显著,表明prkC和yih E基因缺失后,减弱了A.veronii在感染早期对EPC细胞的毒性,且相比yih E,prkC的影响更明显;斑马鱼致病性试验结果显示,缺失株△prkC的LD50比野生株TH0426升高了2.04倍,毒力下降明显,缺失株△yih E则升高了1.44倍,毒力有所下降,但变化并不显著;表明prkC和yih E基因的缺失均减弱了A.veronii对斑马鱼的致病性,但相比yih E,prkC的影响更明显。此外,运动性检测结果表明prkC基因的缺失显著影响了A.veronii的运动能力,且缺失株△prkC的鞭毛发生明显脱落,表明prkC基因的缺失显著影响了A.veronii TH0426鞭毛的形成。（2）比较蛋白质组学分析结果显示,缺失株△prkC与野生株TH0426之间共存在314个差异表达蛋白,其中上调表达蛋白142个和下调表达蛋白172个;生物信息学分析结果表明,prkC基因缺失主要引起与A.veronii趋化过程、鞭毛组装、双组分系统、细菌分泌系统以及生物被膜形成等代谢通路相关蛋白表达量下调;此外,prkC基因的缺失导致A.veronii Mot A、Mot B、Fli M和Fli N等16个鞭毛形成主要相关蛋白的表达量显著下调,与缺失株△prkC鞭毛脱落,运动能力减弱等表型变化一致,表明prkC基因参与调控A.veronii鞭毛的形成。（3）磷酸化修饰组学分析结果显示,缺失株△prkC与野生株TH0426之间共存在75个差异修饰位点,其中上调修饰位点56个,对应蛋白40个,下调修饰位点19个,对应蛋白17个;进一步利用生物信息学对磷酸化差异蛋白功能分析发现,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Prk C通过磷酸化修饰参与了A.veronii转录、翻译、基础代谢及细菌趋化性等多个生物学过程,且分析结果表明Prk C参与调控A.veronii鞭毛蛋白Fli C的磷酸化修饰和蛋白表达。（4）通过Pull-down-MS技术筛选获得8个与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Prk C有潜在相互作用的蛋白,包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、钠离子易位NADH-泛醌还原酶亚基A、细菌鞭毛丝状体蛋白Fli C、细胞分裂蛋白Fts Z、谷氨酸-t RNA连接酶Glt X、细菌趋化蛋白Che V、柠檬酸合成酶Glt A和异柠檬酸脱氢酶Icd;此外,通过体外Pull-down实验证实了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Prk C与鞭毛蛋白Fli C存在直接互作关系,表明Prk C通过磷酸化修饰直接作用于鞭毛蛋白Fli C,进而影响A.veronii鞭毛的形成。综上所述,本研究结果表明A.veronii丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Prk C是一个重要的全局调控因子,参与调控A.veronii的生长分裂、毒力、趋化特性、鞭毛的组装及合成等多个生物学过程,研究结果为进一步明确A.veronii丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Prk C的功能奠定了基础,同时也为进一步阐明维氏气单胞菌致病机理提供了重要依据。