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背景帕金森病(Parkinson’s disease,PD)仅次于阿尔茨海的第二最常见的神经退行性疾病,其特点是黑质致密区(substantia nigra par compacta,SNpc)多巴胺能神经元(dopaminergic neurons,DA neurons)进行性缓慢的损失。PD的发病机制虽然尚待完全阐明,但是大量研究证明神经系统炎症在PD发病过程中发挥了至关重要的作用。外周免疫细胞不容易进入神经系统中,而进化倾向于选择小胶质细胞(microglia)作为中枢神经系统(central nervous system,CNS)的常驻免疫细胞,作为抵御有害刺激的第一线保护细胞。广泛的研究表明,过度激活的小胶质细胞与DA能神经元的损失有关。细胞焦亡(pyroptosis)是新发现的促炎性细胞死亡方式,通过诱发炎症反应同时破坏细胞膜完整性导致细胞死亡,近年来发现小胶质细胞焦亡与帕金森病的发病有密切关系。以流行病学为统计分析的结果表明,在PD患者中,男性数量明显多于女性,并且男性的症状相比女性稍重,预示着雌激素(estrogen)可能在PD中发挥着重要的作用。现已有许多研究证实,雌激素可通过雌激素受体(estrogen receptor,ER)介导而发挥生物学效应。雌激素受体在中枢神经系统中广泛分布,中脑黑质和纹状体等神经元和神经胶质细胞中也有分布,表明雌激素受体很有可能在雌激素的神经保护作用中发挥重要作用。然而长期的研究表明,雌激素的长期应用可引起许多不良的副作用。因此,寻找具有类雌激素样作用且副作用小的天然来源的小分子药物,来代替雌激素,是当前PD研究领域的前沿热点。甘草苷(liquiritin,LIQ)是中草药甘草的主要有效成分之一,近年文献报道其在神经系统疾病中有着广泛的作用,与此同时其结构式与雌激素相似,但是LIQ是否能通过ER调节小胶质细胞焦亡起到神经保护作用未曾报道。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)能够诱导小胶质细胞的激活和促炎症因子的分泌,从而促进黑纹状体多巴胺通路的变性,进而直接引起神经炎症介导的多巴胺丢失的作用。而且LPS也是引起小胶质细胞焦亡的常见诱导因素。因此在本研究中,我们使用LPS诱导的小鼠小胶质细胞株BV2细胞作为PD的细胞焦亡模型,探讨甘草苷抑制小胶质细胞焦亡的作用和机制。目的1.明确甘草苷抑制小胶质细胞焦亡的作用。2.阐明甘草苷通过靶向雌激素受体抑制小胶质细胞的机制。方法1.研究甘草苷抑制小胶质细胞焦亡的作用。1.1甘草苷对BV2活力的影响。经过二甲基亚砜和不同浓度甘草苷处理BV2细胞后,利用MTT法检测不同浓度的甘草苷处理细胞对细胞活力的影响。1.2建立小胶质细胞焦亡模型、确定甘草苷的作用浓度(有效浓度)及研究甘草苷的作用。(1)根据实验要求将BV2细胞分为以下三组:(1)Control组:溶剂(DMSO)对照组;(2)LPS组:LPS诱导BV2细胞焦亡模型组,DMSO+LPS;(3)不同浓度的甘草苷+LPS组:分别用5μM、10μM的甘草苷预处理30min后,再加入LPS(1mg/mL)继续共处理;(2)Hoechst 33342/碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色荧光显微镜法检测细胞焦亡及甘草苷的作用于细胞焦亡情况;使用qPCR及Western blot技术检测IL-1β的mRNA和蛋白的表达变化;(3)Western blot检测细胞焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1、GSDMD表达水平的变化;以及细胞焦亡相关上游信号通路NF-κB相关蛋白IκBα、p65的磷酸化表达情况;2.研究甘草苷通过靶向雌激素受体抑制小胶质细胞的机制。2.1通过PharmMapper对甘草苷可能结合的潜在靶点进行预测。2.2通过Sybyl 2.0X、Pymol及Autodock 4.0软件分析甘草苷与雌激素受体结合的情况。2.3利用雌激素抑制剂进行验证,根据实验需求分为以下四组,(1)Control组:溶剂对照组;(2)LPS组:LPS诱导BV2细胞焦亡模型组,DMSO+LPS;(3)甘草苷+LPS组:先用10μM的甘草苷孵育BV2细胞30min后,再加入LPS(1mg/mL)继续共处理24小时;(4)Fulvestrant(雌激素抑制剂)+甘草苷+LPS组:1μM Fulvestrant预处理30min后,加入10μM的甘草苷预处理30min,再加入LPS(1mg/mL)继续共处理24小时。Western blot技术检测细胞焦亡相关蛋白C-caspase1、N-GSDMD的表达变化。结果1.当甘草苷浓度达到50μM时,仍对BV2的活力无明显影响;2.甘草苷能明显减少LPS诱导的BV2细胞焦亡;3.甘草苷可以明显抑制LPS诱导的炎症因子IL-1β的mRNA及蛋白的表达水平;4.甘草苷能显著抑制LPS诱导的细胞焦亡相关蛋白的表达;5.甘草苷可减少LPS引起的细胞焦亡上游信号通路NF-κB相关蛋白表达水平;6.甘草苷可能与雌激素受体靶向结合;7.雌激素受体抑制剂可降低甘草苷对LPS诱导的BV2细胞焦亡相关蛋白C-caspase1、N-GSDMD的抑制作用。结论在LPS引起的BV2细胞焦亡模型中,甘草苷能够明显抑制BV2细胞发生焦亡。其作用机制可能是通过与雌激素受体结合后,发挥雌激素样作用,通过NF-κB信号通路,降低细胞焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、C-caspase1、GSDMD的表达,进而减少IL-1β的表达而抑制细胞焦亡。其结果为甘草苷在治疗PD等神经退行性疾病中的潜在应用提供了初步的实验依据。