第一部分:七氟醚对幼年期大鼠学习认知功能的影响目的:探究七氟醚麻醉对幼年期大鼠学习和认知功能潜在的影响,七氟醚对海马组织中脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达的影响。方法:将四周龄大鼠暴露于3.5%七氟醚中,每天1h,持续建模2周;对照组大鼠暴露于氧气与空气的混合气体中,每天1h,持续2周。采用Morris水迷宫实验对各组大鼠的学习和记忆能力进行评估,并利用荧光定量PCR对建模大鼠海马组织中BDNF基因的表达量进行定量。结果:Morris水迷宫实验发现,逃避时间在两组中均随实验天数的延长而逐渐降低。七氟醚组(Sev组)大鼠与对照组(NC组)大鼠相比,其逃避时间具有统计学意义。从实验第二天开始,Sev组大鼠逃避时间较NC组相比明显增加(P<0.05);在空间探索试验中:Sev组大鼠(4.83±0.75)在90 s内穿越站台次数明显少于NC组大鼠(7.50±1.05)(P<0.05)。PCR结果显示,Sev组海马中BDNF基因的表达水平显著低于NC组(P<0.01)。结论:七氟醚可导致幼年期大鼠海马组织中BDNF基因表达下调,进一步影响神经系统发育,短期内损害幼年期大鼠的学习和记忆能力。第二部分:七氟醚模型大鼠多器官转录组测序分析目的:七氟醚是一种常用于儿科手术中进行诱导和维持全身麻醉的吸入性麻醉药,但很少有研究关注其多器官毒性及其背后的机制。本文采用转录组测序的方法探究吸入七氟醚麻醉对大鼠多器官损伤的分子特征,寻找七氟醚吸入麻醉导致大鼠学习认知功能障碍的潜在信号通路,并构建基因调控网络。方法:通过将幼年期大鼠暴露于3.5%七氟醚的环境中构建了七氟醚吸入麻醉模型,正常对照组大鼠暴露于氧气与空气的混合气体中,持续7天,每天1h;收集大鼠肺,脑皮质,海马和心脏组织进行转录组测序(RNA-seq),利用IPA(Ingenuity Pathway Analysis)工具分析探究七氟醚吸入麻醉对幼年期大鼠肺,脑皮质,海马和心脏组织基因表达的影响。利用R语言相关软件包分析差异表达基因(DEGs)、基因功能(GO)及通路(KEGG),利用CytoScape绘制基因调控网络。结果:RNA测序分析的结果显示,肺、海马和大脑皮层的转录组变化多于心脏,心脏中七氟醚组和正常对照组间的DEGs数量最少。IPA分析结果显示,肺和大脑皮层中激活了多种应激信号传导通路,例如炎症通路,而海马中轴突引导信号传导通路高度丰富。DEGs的生物学功能富集和细胞凋亡相关功能富集为七氟醚对多器官发育和诱导细胞死亡的有害作用提供了有力的证据;BCKDHB和SCN1B等在七氟醚引起的组织损伤基因调控网络中起到主要调控作用。结论:这是一次使用幼年期大鼠模型对七氟醚进行毒理学评估的研究。七氟醚吸入麻醉主要通过引起炎症通路活化导致组织损伤,诱导神经细胞凋亡,进一步影响器官的发育,造成学习和认知功能障碍,BCKDHB和SCN1B等基因起到关键的调控作用。这项研究从分子机制对七氟醚引起可能的儿童脑损伤和肺损伤情况提供了一些新的实验证据。第三部分:BCKDHB基因干扰对神经细胞的影响目的:利用基因干扰技术,探究支链酮酸脱氢酶E1,β多肽(branched chain keto acid dehydrogenase E1,beta polypeptide,BCKDHB)基因干扰对神经细胞凋亡及迁移的影响。方法:利用胎鼠进行神经元原代细胞的培养,并用MAP2抗体对元代细胞进行细胞免疫荧光鉴定;构建合成BCKDHB过表达和干扰质粒,通过质粒转化及扩大培养获得BCKDHB过表达和干扰细胞株,并通过PCR和WB实验验证各实验组BCKDHB基因及蛋白的表达,验证对BCKDHB的表达干扰成功;最后通过AV/PI凋亡实验及Transwell试验检测BCKDHB基因干扰后神经元细胞的凋亡和迁移能力变化。结果:分离培养的细胞MAP2免疫荧光染色结果显示具有神经元原代细胞特征;荧光定量PCR和WB实验结果显示BCKDHB基因的过表达及干扰质粒构建成功,对BCKDHB基因及蛋白表达具有显著的调控作用;细胞凋亡实验结果显示,BCKDHB基因的过表达对神经元细胞的凋亡能力有显著的促进作用,抑制BCKDHB的表达可以降低神经元细胞的凋亡能力;Transwell试验结果显示BCKDHB基因对细胞迁移无显著影响。结论:BCKDHB基因与神经元细胞凋亡密切相关,表明线粒体依赖性细胞凋亡可能是七氟醚损伤的重要表现。