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背景与目的缺血性脑血管疾病的高致残率严重影响患者的生存质量,脑缺血损伤引起的神经元结构破坏和缺失是引起功能障碍的病理关键。针对脑缺血损伤引起的生化、代谢改变,保护神经元免于受损,或促进脑缺血损伤后神经细胞再生成为干预损伤、恢复功能的重要策略。目前药物性的神经保护研究和临床应用仍欠理想。人来源脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)具有较强的增殖能力和多向分化潜能,可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等神经细胞,成为脑缺血损伤后神经细胞再生理想的种子来源。鉴于人来源脐带间充质干细胞体外诱导剂的毒副作用和体外分化后移植脑内较弱的存活能力,近年来,对体外纯化、扩增培养的人来源脐带间充质干细胞移植脑内以治疗脑缺血损伤成为研究的热点。因此,开展人来源脐带间充质干细胞移植在神经细胞再生和神经功能修复方面的研究对脑缺血损伤具有重要意义。中医药以其上千年的历史经验累积,在缺血性中风的治疗上具有明显优势,能有效降低致残率及致死率,促进运动、感觉及语言等多项神经功能障碍的恢复。中医药结合神经干细胞移植能否对缺血性中风的治疗产生协同促进作用,并进一步促进移植后神经干细胞的存活、增殖及分化,值得我们深入研究。本研究依据缺血性中风患者“肾虚”与“血瘀”的关系,以补肾为主,兼以活血,由此而得的肾脑复元汤是治疗缺血性中风的有效方药,具有益肾生髓、活血通络之功效,经导师多年临床应用证明可明显改善脑卒中患者的神经功能,提高临床疗效,降低致残率,提高生活质量。鉴于上述,开展中医药联合人来源脐带间充质干细胞移植治疗脑缺血损伤研究具有重要意义。本研究从大脑中动脉栓塞(MCAO,middle cerebral artery occlusion)大鼠神经细胞再生等方面评价肾脑复元汤、h UC-MSCs移植及其联合对脑组织的保护作用,并采用免疫组化及Western-blot法从其对碱性成纤维生长因子(bFGF,basic fibroblast growth factor)、脑源性神经营养因子(BDNF,brain derived neurotrophic factor)表达的影响方面探讨其可能的作用机制。方法本研究以SD大鼠为研究对象,拴线阻塞大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血再灌注动物模型,将采用组织贴壁法体外分离培养的人脐带间充质干细胞(h UC-MSCs)行侧脑室定位注射。动态观察移植后早期(3d)、中期(7d)、后期(14d、28d)大鼠的神经功能和生存状况变化采用病理形态学、免疫组织化学法以及免疫组织化学双标法,从神经功能综合评分、脑梗塞灶及神经细胞凋亡情况等方面观察肾脑复元汤对人脐带间充质干细胞移植保护脑缺血损伤的影响;从神经元和神经胶质细胞特异性标志蛋白以及与之相关的神经营养因子表达的变化方面探讨肾脑复元汤联合人脐带间充质干细胞移植对神经细胞的保护作用及可能的作用机制。结果1.人来源脐带间充质干细胞的体外培养及移植后存活情况1.1采用组织贴壁法体外培养HUC-MSCs的效果理想,可在短期内移植所需的HUC-MSCs;采用人来源脐带间充质干细胞冻存体系,复苏细胞存活率在50%以上,经检测和正常培养细胞无明显差异,也可以稳定继续传代至20代以上;侧脑室移植HUC-MSCs操作易行,细胞悬液少有外漏,移植途径可取。1.2通过检测人来源脐带间充质干细胞移植后在脑内存活(或分化)情况,发现只有在急性期(第3天)可以在脑内发现少量抗人细胞核染色阳性细胞,后期(第7、14天)几乎找不到阳性细胞表达,这说明HUC-MSCs异体移植后很难在宿主体内真正存活或者分化,这可能与其无法适应宿主体内内环境等因素有关,也就说明HUC-MSCs并不能通过在宿主体内归巢、迁移、存活、定向分化以修复受损脑组织。2.肾脑复元汤联合HUC-MSCs对缺血性中风脑组织的保护作用2.1脑缺血后,大鼠出现明显的肢体偏瘫、乏力、反应迟钝等神经功能缺损症状,HE及TUNEL染色示大量细胞坏死、变性、排列紊乱;在不做任何药物干预情况下(模型组),脑组织自身修复主要以神经胶质细胞增殖(GFAP表达)为主,神经元增殖(MAP-2表达)并不显著。2.2肾脑复元汤与HUC-MSCs均可明显改善脑梗死后大鼠各项神经功能,其中中药组(第14天)、干细胞组及联合组(第3、7天)后m NSS评分均低于模型组(P<0.01或P<0.05),细胞凋亡较模型组减轻(P<0.01),且与模型组相比MAP-2表达明显升高(P<0.05或P<0.01),GFAP表达较模型组明显升高(P<0.05或P<0.01)。此外,联合组在m NSS评分(第14天)、MAP-2(第14天)及GFAP表达(第7天)及凋亡(第14天)与中药组及干细胞组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。3.肾脑复元汤联合HUC-MSCs对缺血性中风脑组织中bFGF,BDNF的影响3.1免疫组化结果显示,与模型组相比,中药组(第14、28天)、干细胞组及联合组(第7、14天)BDNF表达明显升高(P<0.05或P<0.01);联合组在第14天BDNF表达较中药组及干细胞组升高(P<0.05);中药组(第7天)、干细胞组及联合组(第3、7天)bFGF表达较模型组明显升高(P<0.05或P<0.01),联合组第7天bFGF较中药组及干细胞组升高(P<0.05),14、28天仍维持在高水平。3.2 Western-blot结果显示,模型组bFGF,BDNF表达较假手术组明显升高(P<0.05);与模型组相比,中药组(第14、28天)、干细胞组、联合组(第7、14天)bFGF,BDNF表达上升(P<0.05或P<0.01);联合组(第14天)bFGF,BDNF表达较中药组及干细胞组上升(P<0.05)结论综合上述研究,结果提示:1.采用组织贴壁法体外HUC-MSCs的效果理想,可在短期内移植所需的人来源脐带间充质干细胞,移植后的HUC-MSCs主要在缺血后早期(第7天)内对MCAO大鼠脑组织具有保护作用。在后期异体移植的HUC-MSCs很难在宿主体内真正存活或者分化。且人来源脐带间充质干细胞并不能通过在宿主体内归巢、迁移、存活、定向分化以修复受损脑组织。2.肾脑复元汤与HUC-MSCs均可明显改善脑梗死后大鼠各项神经功能,减少细胞坏死,改善神经细胞存活,且HUC-MSCs的治疗效应主要在缺血后早期,肾脑复元汤的治疗效应主要发生在恢复期。与中药组及干细胞组相比,联合组可以更加显著地减少脑缺血后细胞凋亡,改善神经细胞存活,促进神经功能恢复,说明肾脑复元汤与人来源脐带间充质干细胞联用后,治疗效应显著提高。3.肾脑复元汤与人来源脐带间充质干细胞均对bFGF,BDNF蛋白产生一定的调控作用,说明二者在实验中均可表现出脑缺血后神经保护效应,其机制与调控bFGF,BDNF因子表达相关。因此认为,肾脑复元汤联合HUC-MSCs移植对MCAO大鼠神经细胞再生具有促进作用,其发挥效应的主要阶段不同(HUC-MSCs主要在缺血后早期,肾脑复元汤主要在恢复期),且联合能发挥更大效应。其作用可能是通过上调神经营养因子bFGF,BDNF的表达实现。