近年来研究发现乏氧是实体瘤中一种常见现象，是实体肿瘤微环境的基本特征之一。乏氧作为一种应激源，能激活肿瘤细胞内的一系列基因对乏氧作出应答反应，使肿瘤细胞内很多基因转录活性发生改变，其基因产物引起乏氧肿瘤细胞的一系列生物学行为改变。研究表明，在乏氧环境中为了保持能量供应，肿瘤细胞促血管生成能力极大提高，使肿瘤细胞更具有侵袭性，容易发生远处转移。而且乏氧会导致肿瘤细胞对放化疗的抗拒性增加，从而导致治疗失败。而在此过程中，乏氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）起关键作用。但这种复杂的机制目前尚不清楚。因此HIF-1作为乏氧环境中起关键作用的转录因子，已成为近年来的研究热点。HIF-1是存在于哺乳动物和人体内一种转录因子，它是一个属于bHLH-PAS蛋白族的转录因子，由HIF-1α和HIF-1β两个亚单位组成。HIF-1的稳定和活性是由HIF-1α决定的，且HIF-1α是专一受O₂调节的亚基。由于在乏氧诱导肿瘤基因表达的信息通路上，HIF-1α起着中枢纽带作用。因此，研究HIF-1α与肿瘤生长、浸润、转移和治疗方面的关系有重要的意义。食管癌作为我国高发肿瘤，是否也存在乏氧耐受的分子机制目前尚不十分清楚。关于HIF-1α在食管癌中的表达研究较少，其与食管癌血管生成及化疗耐药的关系目前未见系统的研究报道。特别是其是否参与食管癌化疗耐药及其机制的研究，目前未见报道。为了探讨HIF-1α在食管癌组织中的表达及HIF-1α与食管癌血管生成的关系，本文采用半定量聚合酶链反应技术及免疫组化技术检测食管鳞癌组织中HIF-1α在mRNA水平及蛋白水平的表达，采用免疫组化技术检测食管鳞癌组织中VEGF、CD34的表达，观察了HIF-1α在食管癌中的表达情况及其与临床病理特征、VEGF和微血管密度的关系。为了探讨HIF-1α是否通过上调VEGF的表达而促进食管癌血管生成的机制，本文以食管鳞癌细胞株EC9706为研究对象，通过化学性乏氧诱导剂氯化钴（cobaltchloride，COCl₂）建立乏氧模型，体外模拟肿瘤乏氧微环境。采用半定量RT-PCR、Western-blot、免疫细胞化学技术检测乏氧诱导的HIF-1α、VEGF表达情况。进一步利用RNA干扰技术（RNA intefercnce，RNAi）观察小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）转染EC9706细胞后乏氧诱导的HIF-1α和VEGF的表达的改变，初步探讨了HIF-1α在乏氧条件下对食管癌血管生成的调控作用及其机制以及以HIF-1α为靶点抗食管癌血管生成治疗的可能性。为探讨HIF-1α是否与食管癌化疗耐药有关及其参与耐药的机制，采用免疫组化技术检测食管鳞癌组织中HIF-1α的表达，并与临床化疗疗效相结合，探讨HIF-1α与食管癌化疗疗效的关系。从体外方面，以EC9706为研究对象，通过化学性乏氧诱导剂建立乏氧模型，采用MTS、半定量RT-PCR、免疫细胞化学、RNA干扰技术进一步从多药耐药、凋亡、细胞周期等方面，探讨了HIF-1α参与食管癌细胞乏氧条件下对不同机制的化疗药物产生耐药的机制。并进一步体外探讨以HIF-1α为新的靶点，应用RNA干扰技术逆转食管癌耐药的新途径。为以此为突破口进一步提高食管癌的化疗水平提供理论依据。第一部分乏氧诱导因子-1α在食管鳞癌组织中的表达及乏氧调节方法1．应用半定量RT-PCR及免疫组化技术对46例食管鳞癌组织及20例正常食管黏膜组织进行HIF-1αmRNA及蛋白水平的检测。2．应用化学乏氧法COCl₂（COCl₂加入培养液的终浓度为75μmol/l）体外模拟肿瘤乏氧微环境。3．应用半定量RT-PCR、免疫细胞化学、Western-blot检测乏氧环境下食管鳞癌细胞EC9706中HIF-1αmRNA及蛋白的表达情况。4．统计学处理：所有实验数据应用SPSS11.0软件进行分析，统计学数据用均数±标准差（（?）±s）表示，采用χ²检验、t检验、单因素方差分析、相关性检验。以α=0.05作为检验水准。结果1．食管鳞癌组织及正常食管黏膜组织中均可见HIF-1αmRNA的表达，食管鳞癌组织中HIF-1αmRNA表达水平（范围：0.32～1.62；平均1.17±0.25）显著高于正常食管黏膜组织（范围：0.18～0.58；平均0.35±0.12）（P＜0.05）。而且癌组织中HIF-1αmRNA表达强弱不一，46例癌组织中高表达者（大于1.17）为24例，高表达率为52.17％。2．免疫组化法显示：食管鳞癌组织中HIF-1α蛋白的表达位于胞浆/核中，表达阳性率为41.31％（19/46）；而在正常食管黏膜组织中呈阴性表达。3．食管鳞癌组织中HIF-1αmRNA表达水平与HIF-1α蛋白表达阳性率之间有显著正相关（P＜0.05）。4．食管鳞癌组织中HIF-1αmRNA表达水平与肿瘤组织学分级、淋巴结转移、浸润深度、临床分期均无相关性（P＞0.05）。5．食管鳞癌组织中HIF-1α蛋白的表达与淋巴结转移、浸润深度有显著相关性（P＜0.05）。6．免疫细胞化学法结果：常氧培养EC9706细胞HIF-1α蛋白表达阴性，化学乏氧法培养8h，可见细胞浆/核呈强棕黄色染色。7．Western-blot结果显示：化学乏氧法4h即可诱导食管鳞癌EC9706细胞HIF-1α蛋白的表达，8h处于稳定表达状态。乏氧8h再氧合4h后HIF-1α蛋白表达显著减弱。8．而乏氧前后HIF-1αmRNA表达水平无明显变化（P＞0.05）。第二部分乏氧诱导因子-1α与食管癌血管生成的关系及其机制方法1．血管生成抗原指标检测VEGF、CD34。应用免疫组化技术对上述46例食管鳞癌组织及20例正常食管黏膜组织标本进行VEGF、CD34的检测。微血管密度（MVD）以CD34特异性血管内皮染色强度计算。2．应用化学乏氧法CoCl₂（CoCl₂加入培养液的终浓度为75μmol/l）体外模拟肿瘤乏氧微环境。3．利用RNA干扰技术沉默HIF-1α基因的表达。应用半定量RT-PCR检测HIF-1α基因沉默效果。4．应用Western-blot和免疫细胞化学技术检测HIF-1α基因沉默后乏氧诱导HIF-1α蛋白表达变化。5．采用半定量RT-PCR、免疫细胞化学技术检测常氧培养细胞、乏氧培养细胞及RNA干扰后乏氧培养细胞中VEGF表达的变化。6．统计学处理：所有实验数据应用SPSS11.0软件进行分析，统计学数据用均数±标准差（（?）±s）表示，采用χ²检验、t检验、单因素方差分析。以α=0.05作为检验水准。结果1．VEGF阳性表达位于细胞浆内，食管鳞癌组织中阳性表达率为58.70％，显著高于正常食管黏膜组织的4.34％（P＜0.05）。2．以组织中微血管内皮细胞CD34免疫组化染色评估MVD，癌组织中MVD范围在10～101之间，平均46.12±7.64。3．食管鳞癌组织中VEGF的表达与食管癌浸润深度、淋巴结转移显著相关（P＜0.05）。MVD与食管癌浸润深度、淋巴结转移及临床分期显著相关（P＜0.05）。4．食管鳞癌组织中HIF-1αmRNA表达水平与VEGF表达及MVD均无相关性（P＞0.05），而HIF-1α蛋白的表达与VEGF表达及MVD均呈显著正相关（P＜0.05）。5．针对HIF-1α基因的siRNA干扰技术，有效沉默HIF-1α基因的表达及乏氧诱导的HIF-1α蛋白表达。6．EC9706细胞乏氧培养后VEGF在mRNA水平和蛋白水平均表达增加（P＜0.05）。针对HIF-1α基因的siRNA干扰技术，有效抑制乏氧诱导VEGF表达增加（P＜0.05）。第三部分食管鳞癌中HIF-1α的表达与食管癌化疗耐药的关系及其机制方法1．48例中晚期食管鳞癌患者采用顺铂／紫杉醇方案化疗，评定疗效。2．应用免疫组化技术检测上述病例的石蜡包埋标本中HIF-1α蛋白的表达，探讨其与化疗疗效的关系。3．利用RNA干扰技术沉默HIF-1α基因的表达。4．采用MTS比色法检测常氧培养组和乏氧培养组EC9706细胞在顺铂／紫杉醇作用下细胞的抑制率。及RNA干扰后乏氧培养细胞在顺铂／紫杉醇作用下细胞的抑制率。5．采用RT-PCR、免疫细胞化学技术分别检测常氧和乏氧环境下EC9706细胞中的MRP1、Bcl-2、Bax的表达。及RNA干扰后乏氧培养细胞中的MRP1、Bcl-2、Bax表达变化。6．应用原位末端标记TUNEL法，Annexin V／PI双标记法检测RNA干扰前后紫杉醇对乏氧培养细胞EC9706细胞凋亡的影响7．用流式细胞仪检测RNA干扰前后乏氧条件下EC9706细胞的细胞周期。8．统计学处理：所有实验数据应用SPSS11.0软件进行分析，统计学数据用均数±标准差（（?）±s）表示，采用χ²检验、t检验、单因素方差分析。以α=0.05作为检验水准。结果1．48例食管鳞癌标本，21例为HIF-1α阳性表达，阳性表达率为43.75％。HIF-1α阳性表达者中无一例CR，5例达PR，化疗有效率为23.81％；而27例HIF-1α阴性表达者，化疗有效者19例，其中CR8例，PR11例，化疗有效率为70.37％。两组比较有显著性差异（P＜0.05）。2．（1）以终浓度为10μg／ml、5μg／ml、2μg／ml的顺铂分别作用于常氧及乏氧培养细胞24h后，每一药物浓度常氧培养组细胞抑制率均显著高于乏氧培养组（P＜0.05）。（2）以终浓度为100μg／ml、50μg／ml、20μg／ml的紫杉醇分别作用于常氧及乏氧培养细胞24h后，每一药物浓度常氧培养组细胞抑制率均显著高于乏氧培养组（P＜0.05）。3．（1）以终浓度为10μg／ml、5μg／ml、2μg／ml的顺铂分别作用于乏氧条件下未转染、转染control siRNA和转染HIF-1αsiRNA培养细胞，相同药物浓度RNA干扰组抑制率显著高于未转染组及转染control siRNA组（P＜0.05）。（2）以终浓度为100μg／ml、50μg／ml、20μg／ml紫杉醇分别作用于乏氧条件下未转染、转染control siRNA和转染HIF-1αsiRNA培养细胞，同一药物浓度RNA干扰组抑制率显著高于未转染组及转染control siRNA组（P＜0.05）。4．乏氧后EC9706细胞MRP1在mRNA水平和蛋白水表达均增加（P＜0.05）。同样乏氧条件，转染HIF-1αsiRNA后EC9706细胞较未转染及转染controlsiRNA组细胞相比，MRP1无论是mRNA水平或蛋白水平均表达减少（P＜0.05）。5．TUNEL法检测结果显示：50μg／ml紫杉醇作用于相同乏氧条件下EC9706细胞24h后，转染HIF-1αsiRNA组出现大量凋亡细胞，凋亡细胞核被染成棕黄色，阳性率达38.63％，同未转染组的阳性率12.54％、转染control siRNA组的13.69％相比，差异均有显著性（P＜0.05）。未转染组与转染阴性组间差异无统计学意义。（P＞0.05）。6．流式细胞仪Annexin V FITC／PI测定细胞凋亡率结果：50μg／ml紫杉醇作用于相同乏氧条件下EC9706细胞24h后，转染HIF-1αsiRNA组可显著引起细胞凋亡，凋亡率达（36.57±3.36）％，与未转染组（13.54±2.61）％、转染controlsiRNA组（15.61±2.42）％相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。而未转染组与转染control siRNA组差异无统计学意义（P＞0.05）。7．乏氧后EC9706细胞，Bcl-2在蛋白水平和mRNA水平表达无显著变化（P＞0.05）。相同乏氧条件，转染HIF-1αsiRNA后EC9706细胞较未转染及转染control siRNA组细胞相比，Bcl-2在蛋白水平和mRNA水平表达均无显著性差异（P＞0.05）。8．乏氧后EC9706细胞，Bax在蛋白水平和mRNA水平表达均显著降低（P＜0.05）。相同乏氧条件，RNA干扰组Bax在蛋白水平和mRNA水平较未转染组及转染control siRNA组表达均显著增强（P＜0.05）。而未转染组与转染controlsiRNA组差异无统计学意义（P＞0.05）。9．流式细胞仪检测细胞周期结果显示：常氧培养条件下，EC9706细胞G₁期、S期所占比例分别为（69.05±1.30）％、（23.72±1.30）％，乏氧培养8h组G₁期、S期所占比例分别为（78.29±2.70）％、（11.94±2.70）％，与常氧培养组相比乏氧培养组G₁期显著增加（P＜0.05），S期显著减少（P＜0.05）。RNA干扰组（转染HIF-1αsiRNA）乏氧8h后G₁期、S期细胞所占比例分别为（70.48±1.91）％、（21.86±1.90）％。转染control siRNA组乏氧8h后G₁期、S期所占比例分别为（77.86±2.31）％、（12.07±1.90）％。相同的乏氧条件下转染HIF-1αsiRNA与未转染组／转染control siRNA组相比，S期显著增加（P＜0.05）、G₁期细胞减少（P＜0.05）。结论1．食管鳞癌组织中HIF-1αmRNA水平显著高于正常食管黏膜组织。而食管鳞癌组织中HIF-1α在mRNA表达水平的高低与食管癌临床病理特征、VEGF的表达及MVD无相关性。HIF-1αmRNA水平与蛋白表达阳性率之间有相关性。2．食管鳞癌组织中HIF-1α在蛋白表达水平与淋巴结转移情况、侵润深度均相关。而且食管鳞癌中HIF-1α在蛋白表达水平与VEGF的表达及MVD呈显著正相关。而正常食管粘膜组织中HIF-1α蛋白表达阴性。3．食管鳞癌组织中HIF-1α在蛋白表达水平与化疗疗效有关，表达阳性者化疗有效率低。提示HIF-1α蛋白表达情况可作为预测食管癌化疗疗效的又一新的指标。4．体外化学乏氧法可诱导食管癌细胞HIF-1α蛋白表达，而对RNA水平表达无影响。提示，乏氧主要在转录后水平上影响食管癌细胞中HIF-1α的表达而达到调节其靶基因的目的。HIF-1α在蛋白水平的表达对食管癌的临床治疗具有重要的指导意义。5．针对HIF-1α的RNA干扰技术能有效沉默HIF-1α的基因表达。6．乏氧通过诱导HIF-1α蛋白表达上调VEGF表达引起新生血管形成。通过RNA干扰技术沉默HIF-1α基因表达后，乏氧诱导的VEGF表达可被显著抑制，提示以HIF-1α为靶点抗血管生成治疗的可能性。7．乏氧培养EC9706细胞对顺铂、紫杉醇这两种作用机制不同的药物均产生耐药。通过RNA干扰技术沉默HIF-1α基因表达后，可以逆转乏氧条件下的细胞耐药。8．乏氧通过诱导HIF-1α蛋白表达上调食管鳞癌细胞中多药耐药相关基因（MRP1）的表达可能是乏氧条件下化疗耐药的机制之一。9．乏氧条件下HIF-1α可能通过抑制促凋亡基因Bax的表达而发挥抗凋亡作用从而参与食管癌化疗耐药。10．HIF-1α参与的乏氧所导致EC9706细胞周期停滞可能是乏氧环境下细胞耐药的又一机制。通过RNA干扰技术沉默HIF-1α基因表达后，乏氧导致的细胞周期抑制被解除，从而逆转乏氧条件下的细胞耐药。11．乏氧环境下HIF-1α蛋白的过表达通过上调VEGF的表达导致食管鳞癌细胞促血管生成能力提高以及对不同机制的化疗药物耐药，因此HIF-1α可望成为新的靶点从而提高食管癌的治疗水平。创新点：1．首次系统地探讨了食管鳞癌组织中HIF-1α在mRNA水平及蛋白水平的表达。其蛋白水平的表达有望成为预测食管癌化疗疗效及临床预后的新的指标。2．利用RNAi技术及化学乏氧法，进一步探讨了乏氧环境中食管鳞癌细胞中VEGF在mRNA水平及蛋白水平的表达，从分子水平上明确了乏氧环境中HIF-1α促食管鳞癌血管生成的机制。3．首次系统地从分子水平上探讨了乏氧环境中食管鳞癌细胞耐药的复杂机制：乏氧环境中HIF-1α蛋白表达增加，从而上调MRP1表达；乏氧环境中HIF-1α通过抑制促凋亡基因Bax的表达而使乏氧细胞抗凋亡能力增加；以及乏氧环境中HIF-1α抑制细胞周期中的G₁期向S期转换，使乏氧细胞停滞在G₁期。