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间隙连接（gap junction,GJ）是广泛存在于人体细胞中的膜通道,对细胞生理功能至关重要。GJ是由连接蛋白（Cx）所构成,目前最丰富和研究最广泛的连接蛋白是连接蛋白43（Cx43）。在造血系统中,Cx43分子广泛存在并表达于造血干细胞,造血祖细胞以及骨髓基质细胞中,其参与并维持调节造血环境的稳定。Cx43的异常表达与多种肿瘤复发、转移扩散和预后不良关联。由Cx43分子所形成的通道可选择性地通过多种小分子和大分子物质,使其可能成为直接将药物输送到靶细胞的极具吸引力的分子标识。Cx43不仅可以作为肿瘤生长的促进基因,而且可以作为肿瘤抑制因子。鉴此,对该分子及由其介导的生物学行为和特性的深入研究,有助于更好地了解Cx43在肿瘤发生、发展中的作用,并开发出临床上可行的基于Cx43的治疗方法。因此,研究造血系统疾病中不同情况下Cx43表达水平的改变,尤其在骨髓瘤造血微环境中的骨髓基质细胞中的改变,可能对骨髓瘤的诊疗开辟新的思路。目前在治疗血液系统恶性疾病,实体性肿瘤和代谢遗传等疾病中,常用到造血干细胞移植。目前移植研究的焦点往往集中考虑:如何扩大干细胞来源?如何增加干细胞的数量等等,缺乏对受者骨髓造血微环境的结构和功能完整性的关注,可能是导致移植失败的原因之一。移植前预处理方案中的药物以及预防GVHD大剂量的药物使用;是否对受者骨髓基质细胞中Cx43表达有影响?对其介导的间隙连接功能的影响怎样?鉴此;本研究初步观察Cx43对正常造血调控的影响,通过构建Cx43-/-小鼠模型,以期从化疗及移植层面,了解在Cx43基因敲除以后,对骨髓造血恢复重建是否有影响;而且,为了进一步研究Cx43及其介导的GJIC在MM和基质细胞之间的作用,我们构建了 Cx43-NT过表达细胞,以期了解Cx43羰基末端介导的信号传导是否有助于MM细胞的存活和迁移,以及骨髓基质细胞介导的GJIC是否参与了 MM的克隆性扩增;此外,我们进一步探讨了多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓微环境中脂肪细胞（Ad）在MM发生、发展中的作用。第一部分 连接蛋白Cx43在造血调控及重建中的作用目 的利用条件性基因敲除技术,通过构建造血系统连接蛋白43（Cx43）的基因敲除小鼠（Cx43-/-）模型,来深入探讨其在维持造血细胞的自我更新以及功能稳定中的作用。方法将引进来的转基因小鼠Cx43loxP/loxP和Lyz-Cre/+进行杂交,其后选取其F1雌性子代Cx43loxP/-Lyz-Cre/+和雄性Cx43loxP/loxP合笼后进行回配,将回配后所获得的子代小鼠行基因鉴定,通过提取小鼠尾部组织基因组DNA,采用PCR的方法来鉴定,通过RT-PCR方法筛选出Cx43-/-小鼠,同时分析其不同器官中Cx43基因的表达;获得的小鼠经5-FU（125 mg/kg）处理,分别在化疗前,化疗后第5天、10天以及15天通过眼球取血来分析其血象的改变。Cx43-/-及Cx43+/+小鼠分别给予7.5 Gy（60Co-y）的致死剂量照射,剂量率为1 Gy/min,在照射后6 h分别给予事先准备好的骨髓细胞,按照3×106/只,通过尾静脉注入。2周后处死照射小鼠来检测是否重建造血,分离其股骨切片后,收集小鼠骨髓细胞对其细胞表型进行分析,选用的单抗为抗 CD4、CD45R、TCRαβ,Gr-1、Mac-1,CD8a 抗 slgM、Sca-1,TER119以及CD117;并进行体外的造血细胞集落实验来观察其造血细胞在体外的增殖能力。结 果此研究通过对2种转基因小鼠之间进行杂交和回交,成功的获得了造血系统选择性的Cx43基因敲除小鼠。该类小鼠的骨髓以及外周血细胞中无Cx43表达,其参与造血的组织,如肝脏,脾脏中Cx43表达也明显下调（P＜0.01）,而在心脏和肾脏中,Cx43的表达则无影响,小鼠在成年后,对其外周血象进行分析,未见明显异常,然而其代偿能力以及应急能力均下降,小鼠经过5-FU处理后,检测结果发现其造血功能的恢复明显减缓,5-FU处理15天时检测发现Cx43-/-小鼠造血仍无明显的恢复,其血小板,白细胞和血红蛋白仍处于低位,然而Cx43+/+小鼠造血已基本接近正常水平,2者差别有统计学意义（P＜0.01）;体外行集落试验也证实了 Cx43-/-小鼠的造血干/祖细胞的增殖功能下降,其CFU-GM或CFU-E集落数都明显少于Cx43+/+小鼠（P＜0.01）,但对其骨髓细胞的流式细胞术检测发现,Cx43-/-小鼠骨髓中的Lin-/c-Kit+/Sca-1+细胞亚群,发现该亚群细胞和Cx43+/+小鼠对比,差异并无统计学显著性;Cx43-/-小鼠在化疗或是移植后,其骨髓造血功能重建都延迟,15d时骨髓切片及涂片染色证实其骨髓中造血细胞的增生程度显著低于Cx43+/+小鼠,其脂肪组织显著增多,而且T、B细胞的发育也有异常,其外周血中CD4+CD8+细胞比例比野生型小鼠明显增多（P＜0.05）,但CD4+T细胞却显著减少（P＜0.01）,尤其是TCRαβ亚群细胞的减少尤为明显（P＜0.01）此外,与野生型小鼠相比较,检测Cx43-/-小鼠外周血中的CD45R+sIgM-细胞亚群,发现其比例显著减少（P＜0.01）。结论骨髓中Cx43的基因表达对造血干/祖细胞发育,尤其是处于应急状态时具有重要作用,敲除Cx43基因后能使造血干/祖细胞增殖减慢,造血以及免疫重建功能受损。第二部分 连接蛋白43偶联对多发性骨髓瘤细胞存活和迁移的影响目的为了进一步研究GJIC在MM和基质细胞之间的作用,我们构建了 Cx43-NT过表达细胞,以期了解Cx43羰基末端介导的信号传导是否有助于MM细胞的存活和迁移,以及骨髓基质细胞介导的GJIC是否参与了 MM的克隆性扩增。材料与方法构建了 Cx43跨膜区细胞表达膜,观察了其半通道活,在此基础上分析全长Cx43分子羧基端（S368）其在磷酸化水平;丝裂原活化蛋白激酶途径MAPK信号途径中相关分子ERK1/2、JNK1/2、p38和NFκB等相关分子的变化。检测MM细胞株及骨髓间充质干细胞（MSCs）中Cx43mRNA变化和蛋白表达。染料转移分析MM、MSCs或MM与HUVEC Cx43-NT之间是否存在功能性GJIC。结 果研究证实MM细胞向MSCs或HUVECCx43-N的迁移活性呈现通道依赖性,其作用强于自发性迁移（p＜0.05）,并可通过分泌细胞因子保护MM细胞免受地塞米板介导的细胞凋亡的影响;同时,还发现Cx43分子羧基末端p38和JNK信号通路表达上调参与MM细胞向MSCs或HUVECCx43-NT的迁移过程。结论MM与MSCs之间的GJIC是肿瘤细胞增殖和药物敏感性的重要因素之一,并与MM的发病有关。第三部分 骨髓脂肪细胞促进多发性骨髓瘤细胞生存并上调抗药性目的探讨多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓微环境中脂肪细胞（Ad）在MM发生、发展中的作用;材料与方法油红O染色分析正常及初诊MM（ND-MM）骨髓涂片中骨髓脂肪细胞（BMA）含量;分别收集正常及初诊MM患者间充质干细胞（MSC）,采用体外共培养试验探讨MM对MSC成脂分化的影响以及BMA在MM细胞生存和耐药中的作用。实时定量PCR法检测MSC及MSC衍生Ad中成脂及成骨分化相关基因PPRA-γ,DLK1,DGAT1,FABP4,FASN和ALP表达,蛋白印迹分析培养上清中IL-6、IL-10,SDF-1α,TNF-α和IGF-1水平。结 果ND-MM骨髓涂片油红O染色阳性BMAs显著增多,且与疾病状态相关,治疗有效者骨髓BMA含量下降;发现MM细胞可上调MSC成脂分化相关基因PPRA-γ、DLK1、DGAT1、FABP4和FASN的表达水平,而成骨分化相关基因ALP则明显下调。在MM骨髓微环境中MM细胞与MSC相互作用的直接后果是以成骨细胞为代价促进MSC向Ad分化。且该类Ad的细胞因子分泌谱发生变化;PPRA-γ抑制剂G3335可部分逆转BMA释放细胞因子,由此证实BMA经PPAR-γ信号调控其细胞因子释放,而G3335则可破坏PPRA-γ介导的BMA成熟和细胞因子释放。显著增多的BMA及相关细胞因子有效增强MM细胞的增殖、迁移和耐药性。结论BMA及其相关细胞因子是MM细胞生存、增殖和迁移的促进因素。MM衍生的BMA保护MM细胞免受药物诱导的细胞凋亡,在MM治疗失败和疾病进展起着重要作用。