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鸭坦布苏病毒病是近年影响我国养鸭业的主要疫病之一,引起该病的病原为鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus, DTMUV)。该病主要引起种鸭和蛋鸭产蛋量大幅下降甚至停产,给我国养鸭业造成了重大经济损失。本研究开展了近年该病在广西发生的临床病例的诊断及其病原的相关研究。具体研究内容和结果如下：一、DTMUV的分离鉴定、全基因组测定和遗传变异分析本研究对2012-2015年广西地区疑似发生DTMUV感染的临床病例进行RT-PCR快速诊断,并对阳性临床样品进行病毒分离鉴定,成功分离到四株DTMUV,分别命名为GX120915、GX130330、GX150829、GX151002。对4个DTMUV分离株用BHK-21细胞进行噬斑纯化,获得四株含单一病毒的DTMUV。将纯化的分离株进行全基因组序列测定、遗传变异分析、分子生物学特性研究、毒力测定以及动物回归试验。结果发现,GX120915、 GX130330.GX150829、GX151002的基因组全长分别为10991bp、10991bp、 10990bp、10992bp,仅含一个大的阅读框,编码3425个氨基酸的多聚蛋白,两侧各有一个非编码区。与NCBI公布的51株TMUV核苷酸同源性高于96%,氨基酸的同源性高于98%。GX150829分离株与其他地区分离株亲缘关系更近,属同一分支；GX120915、GX130330、GX151002与广西分离株GX2013G、GX2013H和重庆分离株CQW1的亲缘关系最近,形成了一个小分支,具有地方特色,这与E基因、NS5基因构建的遗传进化树结构相一致。分离株均无血凝活性。分离株的鸭胚半数致死量(ELDso)为10-4-32～10-468/0.2mL。动物回归试验结果表明,GX120915、GX130330、 GX10829、GX151002对7天龄靖西麻鸭有较强的致病力,发病率为60%-80%,死亡率为20%-40%,四株分离株人工感染靖西麻鸭的临床发病特征与自然感染病例相似。二、DTMUV E蛋白主要抗原区域的原核表达与鉴定根据GX120915株结构蛋白E基因序列,设计合成一对特异性引物,RT-PCR扩增1194 bp E基因片段克隆至pMD18-T载体中,测序及酶切鉴定正确后,将目的基因定向克隆至pET-32a表达载体中,测序及酶切鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导获得目的蛋白,同时利用镍离子亲和层析柱对目的蛋白进行纯化,不同浓度尿素进行复性,SDS-PAGE电泳和Western blot结果显示目的蛋白大小约为53 kDa,与预期一致,表明目的蛋白得到表达,且具有良好的免疫原性。三、DTMUV E蛋白间接ELISA方法的建立将表达具有良好免疫原性的E蛋白作为包被抗原,建立检测DTMUV抗体的间接ELISA方法,经过优化条件后,确定判定阴阳性的临界值为0.354。用建立的ELISA方法检测常见鸭源病毒病的阳性血清,检测结果均低于临界值,表明其特异性强；批内和批间重复试验的平均变异系数都小于10%,说明其稳定性好；敏感性高达1：6400,敏感性较高。综上所述,本研究分离与鉴定了4株广西DTMUV,4株分离株对靖西麻鸭有较强的致病性。完成了分离株的病毒蚀斑纯化和全基因组序列测定与分析。成功进行了DTMUV E蛋白主要抗原区域的原核表达及蛋白纯化,获得了具有良好的生物活性的目的蛋白。建立了检测DTMUV抗体的间接ELISA方法,该方法特异性强,敏感度高,稳定性好,可用于临床血清样品的检测。