论文部分内容阅读
芥菜(Brassica juncea L.)是一种重要的十字花科蔬菜作物,然而目前我们对芥菜花期调控的分子机理的细节知之甚少。现已知在春化途径和自主途径中,FLC起到了重要开花抑制作用,在赤霉素和光周期途径中,SVP也能抑制开花,而位于FLC、SVP下游的SOC1,能够整合来自多条开花途径的调控信号,SOC1的表达受到FLC、SVP蛋白负调控。FLC和SVP蛋白都属于MICK类型的MADS转录因子,它们能够识别特定的CArG-box序列。前期试验已经证明,芥菜中FLC和SVP蛋白能够识别并结合到芥菜SOC1基因启动子(编码区上游一段长度为782bp的DNA片段),发生蛋白质-DNA相互作用。但是,FLC和SVP蛋白究竟结合到SOC1基因启动子哪个区段,仍不清楚。因此本试验在已经清楚FLC、SVP蛋白和SOC1基因启动子之间存在相互作用的基础上,利用酵母单杂交技术研究FLC、SVP蛋白与SOC1基因启动子相互作用的结合区域及其相互作用的特异性,为SOCl基因的表达调控及其开花分子机制的深入研究奠定了基础。1、芥菜SOC1启动子的CArG-box分段亚克隆及其与FLC、SVP蛋白互作获得SOC1启动子的分段片段：SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3,每一个小片段都含有一个CArG-box (CC[A/T]6GG)。然后将三个小片段分别连接到酵母载体质粒pAbAi上构建了酵母重组质粒,再将其分别转入酵母菌株Y1H Gold中获得重组酵母菌Y1H[pAbAi-SOC1△1-3]。筛选抑制酵母菌Y1H[pAbAi-SOC1△1-3]生长的环酯肽抗生素(Aureobasidin A,简称AbA)的最低浓度,得到YlH[pAbAi-SOC1 △1-3]的AbA背景浓度分别为100ng/ml、150ng/ml、100ng/ml。接着转入实验室中已经构建好的能够表达融合FLC、SVP蛋白的重组质粒pGADT7FLC、pGADT7SVP,最终得到重组酵母菌Y1H[SOC1△1-3+FLC]和Y1H[SOC1△1-3+SVP]。酵母单杂交表明：重组酵母菌Y1H[SOC1△1-3+FLC]和Y1H[SOC1△1-3+SVP]均能够在含有相应AbA背景浓度的培养基SD/-Leu/AbA*上正常生长。这说明酵母报告基因被激活,从而证明SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3小片段都能够被FLC和SVP蛋白所识别并结合。2、芥菜SOC1启动子的CArG-box缺失突变体与FLC、SVP蛋白互作检测通过分别敲除SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3小片段中的CArG-box,得到了对应的芥菜SOC1启动子的CArG-box缺失突变体(Ⅰ型突变体),并分别命名为：Eliminate1、Eliminate2和Eliminate3。同理筛选出抑制酵母菌Y1H[pAbAi-Eliminate△1-3]生长的AbA的最低浓度,得到Y1H[pAbAi-Eliminate△1-3]的AbA背景浓度分别为100ng/ml、150ng/ml、100ng/ml。接着构建重组酵母菌Y1H[Eliminate △ 1-3+FLC]和Y1H[Eliminate △ 1-3+SVP]。通过酵母单杂交技术验证发现：重组酵母菌Y1H[Eliminate△1-3+FLC]和Y1H[Eliminate△1-3+SVP]均不能够在含有相应AbA背景浓度的培养基SD/-Leu/AbA*上正常生长。这说明Eliminate1、Eliminate2和Eliminate3不能够被FLC和SVP蛋白所识别和结合。由此推断：SOC1-1、 SOC1-2和SOC1-3小片段中的CArG-box均是FLC和SVP蛋白识别和结合的DNA区段。3、芥菜SOC1启动子的CArG-box中A/T碱基互换突变体与FLC、SVP蛋白互作检测通过将SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3小片段中CArG-box中的A/T碱基互换,最后得到了SOC1启动子的CArG-box中A/T碱基互换突变体(Ⅱ型突变体),分别命名为Exchange1、Exchange2和Exchange3。同理筛选抑制重组酵母菌Y1H[pAbAi-Exchange△1-3]生长的AbA的最低浓度,得到Y1H[pAb Ai-Exchange △1-3]的AbA背景浓度分别为100ng/ml、200ng/ml、200ng/ml。接着构建重组酵母菌Y1H[Exchange △ 1-3+FLC]和Y1H[Exchange △ 1-3+SVP],通过酵母单杂交技术验证发现：重组酵母菌Y1H[Exchange△1-3+FLC]和Y1H[Exchange△1-3+SVP]在含有相应AbA背景浓度的培养基SD/-Leu/AbA*上均不能正常生长。由此可见：SOC1启动子额Ⅱ型突变体突变体(Exchange1、 Exchange2 和 Exchange3)不能与FLC、SVP蛋白结合。这说明SOCl启动子片段SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3中CArG-box能够特异被FLC、SVP蛋白所结合,发生蛋白质-DNA相互作用。