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目的角膜上皮细胞功能和结构的完整对保持角膜透明性起着至关重要的作用。角膜上皮细胞具有自我更新的能力，这是由位于角膜缘的干细胞(stem cells，SCs)增殖分化而来的，当角膜缘干细胞部分或全部损伤时，其对角膜上皮的更新及修复功能受到影响，严重时可导致角膜透明性丧失，造成失明。近年，许多临床和基础研究都认为在载体上培养角膜缘干细胞并移植于眼表能够治疗角膜缘干细胞缺乏。以羊膜为载体进行角膜缘干细胞培养和移植的研究已取得了不同程度的成功，发现有无上皮细胞的羊膜对角膜缘干细胞生物学特性的影响有差异。本研究比较以保留上皮羊膜和去除上皮细胞羊膜为载体进行角膜缘干细胞的培养时，对细胞的生物学特性进行比较，为今后将此方法应用于临床治疗提供理论根据。材料与方法1、材料来源：培养用羊膜组织及20个角膜缘组织均来自中国医科大学附属第一医院眼库，供体眼球离体时间均小于12h。2、羊膜的制备按照Tseng等的方法，无菌获取羊膜并冻存，使用前复苏解冻并水化，部分羊膜在胰酶及EDTA中消化后刮除上皮细胞。3、角膜缘干细胞的培养及BrdU标记：采用组织块培养法，将角膜缘组织块种植于保留上皮羊膜(Ⅰ组)和去除上皮细胞羊膜(D组)上进行培养。部分细胞培养7d时用含有10μmol／LBrdU的培养液孵育组织块7d，然后换成无BrdU的正常培养液继续孵育。4、免疫荧光细胞化学染色4％多聚甲醛固定，分别加入适当浓度的一抗及FITC标记的二抗，37℃作用2h，保留上皮羊膜和去除上皮细胞羊膜作对照染色。倒置荧光显微镜观察、照相，于100倍下随机选取3个视野计数统计。5、扫描电镜观察取已长满细胞的羊膜用25g／L的戊二醛固定，备扫描电镜观察。6、统计学方法采用SPSS11.5进行非参数秩和检验的方法对两组细胞在免疫荧光细胞化学染色中的阳性率进行统计学分析。P＜0.05为具有统计学意义。结果1、角膜缘干细胞的培养结果在保留上皮羊膜和去除上皮细胞羊膜上人角膜缘干细胞均可形成单层，扫描电镜下观察见细胞之间建立了连接。2、免疫荧光细胞化学染色结果免疫荧光细胞化学染色结果显示，Ⅰ组细胞BrdU标记阳性率高于D组(Ⅰ组vs D组，P＜0.05)，而对AE5和缝隙连接蛋白(Cx43)表达的阳性率低于D组(Ⅰ组vs D组，P＜0.05)，对增殖细胞核抗原(PCNA)阳性表达两组均较高。保留上皮羊膜和去除上皮细胞羊膜对四种抗体染色均为阴性。结论1、保留和去除上皮细胞的羊膜均有利于人角膜缘干细胞生长2、去除上皮细胞羊膜有利于角膜缘干细胞的分化，而保留上皮羊膜有利于角膜缘干细胞生物学特性的维持